PCR技术及其应用 申川军 广州中医药大学生物化学教研室

参考书  ［美］CW迪芬巴赫  GS德弗克斯勒 本书由美国冷泉港实验室出版社组织国际权威实验室的专家共同研讨并撰稿，是对其10年前广受赞誉的第一版的全新修订。全书共8篇，分别介绍了PCR方法基本原理，样品制备，引物设计，PCR产物的检测，PCR介导的克隆，PCR法制备突变体，以及利用PCR进行基因的差异表达分析，RNA样品的PCR方法等。 70元

背景 由Khorana及其同事于1971年提出：“经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重视该过程便可克隆tRNA基因”。 但由于当时很难进行测序和合成寡核苷酸引物，且当时(1970年)Smith等发现了 DNA限制性内切酶，使体外克隆基因成为可能，所以，使Khorana等的早期设想被人 们遗忘。

１９８３年，在Ｃｅｔｕｓ公司工作的Mullis着手解决用简单的方法鉴定某一段ＤＮＡ的技术问题，有一天晚上他驱车在北部加州１０１号高速公路上，灵机一动想到了一个实际上可以无限扩增某段ＤＮＡ的简单方法，即ＰＣＲ。 在１９８５年的一次学术会议上，此方法首次被介绍，在分子生物科学家中也引起了链反应。大家很快地纷纷采用这个方法，很多人还很奇怪自己怎么没有首先想到这么做。Ｃｅｔｕｓ给了Mullis一万美元的奖金，随后把这项技术的专利以三亿美元的价格转让给另一家生物高技术公司。ＰＣＲ被许多科学家视为近十年来分子生物学领域最重要的一项技术突破。 １９９３年， Kary Mullis因此获得诺贝尔化学奖。

PCR只是一个简单的不起眼玩艺 ——凯利·穆利斯（Kary Mullis) PCR只是一个概念，所发生的奇迹是：PCR概念变成了可操作的实验系统，变成了一项成熟的技术，后者又上升成为新的概念。 … 它最大的特点就是能不断推出新形式。 ——Paul Rabinow

PCR技术 聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction)简称ＰＣＲ，是一项在短时间内大量扩增特定的ＤＮＡ片段的分子生物学技术。 在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸（dNTP）存在的条件下，由耐热DNA聚合酶（如Taq DNA聚合酶）在体外反复酶促合成双链DNA的反应称为聚合酶链式反应。

# PCR 反应五要素： ● 模板DNA： 50-200ng，高纯度，增加反应特异性 ● PCR用引物：根据目的基因两侧特定序列设计。约 20bp左右；Ｇ＋Ｃ含量在40-70％之间； 内部不能有回文序列；３’端不能互补。 ● PCR用DNA聚合酶：嗜热杆菌、耐热95℃ ● PCR用Buffer ：Mg2+是辅基（2.0mM）。浓度太 低酶活力降低；太高反应特异性降低。 ● dNTP： 100μM～200μM

* 反应体系对PCR扩增的影响 pH值,盐离子浓度 反应Buffer Mg 2＋浓度 稳定剂,增强剂 过高非特异性严重 过低无扩增产物 浓度适当 避免反复冻融 dNTP Mixture

单链DNA模板与引物退火 (annealling) 55℃左右，此温度选择根据模板和引物配对结合强弱而定，是反应特异性的决定因素 # 反应分为三步： DNA模板变性 (denaturing) 在93-95℃之间使模板充分变性 单链DNA模板与引物退火 (annealling) 55℃左右，此温度选择根据模板和引物配对结合强弱而定，是反应特异性的决定因素 引物延伸(extension) 70-72℃左右，为Taq酶最适反应温度。

# PCR原理：

* 30次循环后靶序列扩增的数量 7 cycle = 128 Amplicon 8 cycle = 256 Amplicon No. of No. Amplicon Cycles Copies of 1 2 2 4 3 8 4 16 5 32 6 64 20 1,048,576 30 1,073,741,824 1 cycle = 2 Amplicon 2 cycle = 4 Amplicon 3 cycle = 8 Amplicon 4 cycle = 16 Amplicon 5 cycle = 32 Amplicon 6 cycle = 64 Amplicon 7 cycle = 128 Amplicon 8 cycle = 256 Amplicon

# PCR实验方法 1. 向无菌的200或500μl Eppendorf管中依次加入以下溶液 反应物 体积 10×buffer 2.5μl 反应物 体积 10×buffer 2.5μl dNTP(1mM) 2.5μl MgCl2 (25mM) 2.5μl 引物 2μl 模板ＤＮＡ (20ng) 4μl Taq酶 (1U/ul) 1μl 无菌水 10.5μl 总体积 25μl

4. 取20μl反应液加4μl Loading buffer在1.2％琼脂糖凝胶上90-120V，电泳30-50min。 2. 反应体系混匀，离心 3. 在PCR仪上设定以下程序： 4. 取20μl反应液加4μl Loading buffer在1.2％琼脂糖凝胶上90-120V，电泳30-50min。 5. 在凝胶自动成像系统上观察记录实验结果 94℃预变性 3-5min 94℃变性 30s 55℃退火 30s 30个循环 72℃延伸 1min 72℃延伸 10min

# PCR的种类 逆转录PCR（reverse transcription PCR，RT-PCR） 反向PCR（inverse PCR）    嵌套式PCR（nesting PCR）    原位PCR（in situ PCR） 荧光定量PCR（fluorescent quantitative PCR） 多重PCR（multiplex PCR） 实时PCR （Real-time PCR） 多重等位基因PCR（multiplex allele PCR）    不对称PCR（asymmertric PCR）    锚定PCR（anchored PCR）    长片段PCR（long fragment PCR）

RT-PCR mRNA 逆转录酶 杂化双链 DNA聚合酶 cDNA PCR扩增

反向PCR- cDNA 5’-端的快速扩增/5’-RACE

配制PSPtet RNA和人总RNA的混合样品。 设计合成5条引物。 使用5’ RACE法获取PSPtet RNA的5’末端。 切胶回收目的DNA片段。 进行DNA测序确认序列结果。

PSPtet RNA 体外转录

PSPtet RNA的电泳结果 1 ：PSPtet RNA M：DL2,000 Marker 1 M

RNA Mixture 的配制 将PSPtet RNA与人总RNA按1 ：105 的比例混合，此混 合物用于5’ RACE实验。

人总 RNA的电泳结果 1 M 1 : Human Total RNA M :λHind III Marker

PSPtet RNA的5’端序列 AATACAAGCTTGGGCTGCAGGTCAATTCTCATGTTTGACAGCTTATCATCGATAAGCTTTAATGCGGTAGTTTATCACAGTTAAATTGCTAACGCAGTCAGGCACCGTGTATGAAATCTAACAATGCGCTCATCGTCATCCTCGGCACCGTCACCCTGGATGCTGTAGGCATAGGCTTGGTTATGCCGGTACTGCCGGGCCTCTTGCGGGATATCGTCCATTCCGACAGCATCGCCAGTCACTATGGCGTGCTGCTAGCGCTATATGCGTGATGCAATTTCTATGCGCACCCGTTCTCGGAGCACTGTCCGACCGCTTTGGCCGCCGCCCAGTCCTGCTCGCTTCGCTACTTGGAGCCACTATCGACTACGCGATCATGGCGACCACACCCGTCCTGTGGATCCTCTACGCCGGACGCATCGTGGCCGGCATCACCGGCGCCACAGGTGCGGTTGCTGGCGCCTATATCGCCGACATCACCGATGGGGAAGATCGGGCTCGCCACTTCGGGCTCATGAGCGCTTGTTTCGGCGTGGGTATGGTGGCAGGCCCCGTGGCCGGGGGACTGTTGGGCGCCATCTCCTTGCATGCACCATTCCTTGCGGCGGCGGTGCTCAACGGCCTCAACCTACTACTGGGCTGCTTCCTAATGCAGGAGTCGCATAAGGGAGAGCGTCGACCGATGCCCTTGAGAGCCTTCAACCCAGTCAGCTCCTTCCGGTGGGCGCGGGGCATGACTATCGTCGCCGCACTTATGACTGTCTTCTTTATCATGCAACTCGTAGGACAGGTGCCGGCAGCGCCTCTGGGTCATTTTCGGCGAGGACCGCTTTCGCTGGAGCGCGACGATGATCGGCCTGTCGCTTGCGGTATTCGGAATCTTGCACGCCCTCGCTCAAGCCTTCGTCACTGGTCCCGCCACCAAACGTTTCGGCGAGAAGCAGGCCATTAT···········

五条引物与PSPtet RNA的位置关系图 未知 序列 5’ 3’

5条引物的详细序列 RT Primer： 5’-(p)AAAATGACCCAG- 3’ F1 Primer： 5’-GTCCTGTGGATCCTCTACGC- 3’ R1 Primer： 5’-AGCCACTATCGACTACGCGAT- 3’ F2 Primer： 5’-AGCGCTTGTTTCGGCGTGGGTATGGTG- 3’ R2 Primer： 5’-CTGGCGATGCTGTCGGAATGGACGATA- 3’

Step1. 反转录反应 1.反应液组成: 2.反应条件: RNA Mixture 10×RT Buffer RNase Inhibitor (40 U/ml) AMV Reverse Transcriptase XL (5 U/ml) 5’ 磷标记反转录引物 (200 pmol/ml) RNase Free dH2O up to 3.0 mg 1.5 ml 0.5 ml 1.0 ml 15 ml 2.反应条件: 30℃ 10 分钟→ 50℃ 30 分钟→ 80℃ 2 分钟→4℃ 保存

Step2. Hybrid RNA的分解 1.反应液组成: 2.反应条件: 1st Strand cDNA反应液 5×Hybrid RNA Degeneration Buffer RNase H (60 U/ml) dH2O up to 15 ml 1 ml 75 ml 2.反应条件: 30℃; 1 小时→乙醇沉淀

Step3. 单链 cDNA 的自身连接反应 1.反应液组成: 2.反应条件: Step2 的 cDNA 沉淀物 5×RNA (ssDNA) Ligation Buffer dH2O 40% PEG#6000 T4 RNA Ligase (40 U/ml) 8 ml 12 ml 20 ml 1 ml 2.反应条件: 16℃; 过夜反应

Step4. PCR 反应 (1st PCR) 1.反应液组成: 2.反应条件如下: Step3 的连接反应液 10×LA PCR Buffer II dNTP Mixture (2.5 mM each) Primer F1 (20 mM) Primer R1 (20 mM) TaKaRa LA Taq (5 U/ml) dH2O up to 1.0 ml 5.0 ml 8.0 ml 0.5 ml 50 ml 94℃ 3 min 94℃ 30 sec 55℃ 30 sec 72℃ 30 sec 25 Cycles

Step4. PCR 反应 (2nd PCR) 1.反应液组成: 2.反应条件如下: 1st PCR 反应液 10×LA PCR Buffer II dNTP Mixture (2.5 mM each) Primer F2 (20 mM) Primer R2 (20 mM) TaKaRa LA Taq (5 U/ml) dH2O up to 1.0 ml 5.0 ml 8.0 ml 0.5 ml 50 ml 94℃ 30 sec 55℃ 30 sec 72℃ 30 sec 30 Cycles

2nd PCR反应结果 M 1 M : DL2000 Marker 1 ：PCR产物

Step5. 目的 DNA 片段的切胶回收 ●切胶回收电泳结果如下 1 ：回收DNA片段 M ：DL2000 Marker 1 M

Step 6. DNA 片段的序列测定

测序结果与五条引物间的关系 未知 序列 5’ 3’

PSPtet RNA的5’端序列 AATACAAGCTTGGGCTGCAGGTCAATTCTCATGTTTGACAGCTTATCATCGATAAGCTTTAATGCGGTAGTTTATCACAGTTAAATTGCTAACGCAGTCAGGCACCGTGTATGAAATCTAACAATGCGCTCATCGTCATCCTCGGCACCGTCACCCTGGATGCTGTAGGCATAGGCTTGGTTATGCCGGTACTGCCGGGCCTCTTGCGGGATATCGTCCATTCCGACAGCATCGCCAGTCACTATGGCGTGCTGCTAGCGCTATATGCGTGATGCAATTTCTATGCGCACCCGTTCTCGGAGCACTGTCCGACCGCTTTGGCCGCCGCCCAGTCCTGCTCGCTTCGCTACTTGGAGCCACTATCGACTACGCGATCATGGCGACCACACCCGTCCTGTGGATCCTCTACGCCGGACGCATCGTGGCCGGCATCACCGGCGCCACAGGTGCGGTTGCTGGCGCCTATATCGCCGACATCACCGATGGGGAAGATCGGGCTCGCCACTTCGGGCTCATGAGCGCTTGTTTCGGCGTGGGTATGGTGGCAGGCCCCGTGGCCGGGGGACTGTTGGGCGCCATCTCCTTGCATGCACCATTCCTTGCGGCGGCGGTGCTCAACGGCCTCAACCTACTACTGGGCTGCTTCCTAATGCAGGAGTCGCATAAGGGAGAGCGTCGACCGATGCCCTTGAGAGCCTTCAACCCAGTCAGCTCCTTCCGGTGGGCGCGGGGCATGACTATCGTCGCCGCACTTATGACTGTCTTCTTTATCATGCAACTCGTAGGACAGGTGCCGGCAGCGCCTCTGGGTCATTTTCGGCGAGGACCGCTTTCGCTGGAGCGCGACGATGATCGGCCTGTCGCTTGCGGTATTCGGAATCTTGCACGCCCTCGCTCAAGCCTTCGTCACTGGTCCCGCCACCAAACGTTTCGGCGAGAAGCAGGCCATTAT···········

差异显示PCR 又名mRNA 差异显示PCR（mRNA differential display PCR，DD-PCR） 又名差异显示反转录PCR（ differential display reverse transcription PCR，DDRT-PCR）

某组织总mRNA cDNA双链 12种3’锚定引物 （T12MA、T12MG、T12MC、T12MT） 反转录酶 12种cDNA第一链 24~26种5’十聚随机引物分别与 第一链进行PCR反应(288~312次) Taq 聚合酶 cDNA双链 可获得哺乳动物细胞内所有cDNA的片段 M=G、C、A

（荧光）定量PCR 概念： 以外参或内参为标准，通过对PCR终产物的分析或PCR过程的监测，对PCR起始模板量的定量。 分类： 分为三大类，即外标方法、动力学方法、内标共扩增方法。

外标法定量PCR：

外标法——TaqMan 实时荧光定量PCR： 用于荧光定量 PCR 的Taq酶不仅具有DNA 聚合酶活性（延伸DNA引物），而且具有 5’ → 3’ 核酸外切酶活性，可以在延伸过程中实现链替换，并将被替换的单链切断。

原理——荧光标记的基因探针： 5’ 端标记信号基团或报告基团(Reporter, R)，单独存在时可以发光 (FAM、VIC) 3’ 端标记荧光抑制基团（Quencher， Q ）， Q 基团对 R 基团有抑制作用，存在时可抑制R基因的功能，不产生发光现象 当溶液中有PCR产物时，该探针可与模板的特异序列结合，结合位点在两条引物之间 当Taq酶靠近探针时， 激活了Taq酶的外切酶活性，将探针5’ 的R切下，R基团发出荧光 根据荧光强度计算初始模板的数量（同步指数增长）

信号基因R 抑制基因

Rn值是表示在各个反应循环数仪器所检测的荧光信号值

特点： 光谱技术 高精确性 高灵敏性 高特异性 高精确性 PCR 高灵敏性 DNA杂交 高特异性

致突变PCR M. Smith 加拿大生物化学家 发现 “定点突变” 1993年诺贝尔化学奖 源头创新、革命性、突破性。 对基因学、基因组学及蛋白组学的研究具有巨大影响 1993年诺贝尔化学奖

随心所欲地在已知DNA 序列中取代、插入或缺失一定长度的核苷酸片段，改变原有序列的特征。 定义： 随心所欲地在已知DNA 序列中取代、插入或缺失一定长度的核苷酸片段，改变原有序列的特征。 特点： 定向性、可选择性、 无(少) 干扰性、 可靠性、高效率、 简易性、可重复性

原位PCR Hasse等于1990年建立。 是指在组织细胞里进行PCR反应，它结合了具有细胞定位能力的原位杂交和高度特异敏感的PCR技术的优点。 原位PCR既能分辩鉴定带有靶序列的细胞，又能标出靶序列在细胞内的位置，分子水平和细胞水平研究并重。

组织处理有何要求： 处理后的标本，既要保持组织，细胞 的形态结构，并增加细胞膜通透性，又要 充分暴露拟扩增的目的DNA或RNA，使引 物、探针能有效进入胞浆中发生反应。

原位PCR的实验过程： 实验用的标本是新鲜组织、石蜡包埋组织、脱落细胞、血细胞等。其基本方法为多聚甲醛固定组织或细胞，蛋白酶消化处理组织；在组织细胞玻片上滴加PCR反应液进行扩增，覆盖并加液体石蜡后，在原位PCR仪上进行PCR循环扩增，PCR扩增结束后用标记的探针进行原位杂交，最后显微镜观察结果。

1）预处理：      （1）切片常规脱蜡；      （2）0.2mol/L HCl处理10min；      （3）5μg/ml蛋白酶K消化组织37℃10min；      （4）Nase消化组织37℃ 30min；      （5）梯度酒精脱水，室温干燥。 2）原位扩增：      （1）切片滴加特异性序列引物30μLPCR扩增反应液，覆 盖硅化盖玻片，石蜡油封边；      （2）PCR热循环：94℃，1min；55℃，1min；72℃， 1.5min，共25～30个循环，72℃延伸10min；      （3）氯仿洗去盖玻片，4％多聚甲醛后固定10min，梯度 酒精脱水，干燥。  3) 原位杂交：      （1）加标记探针的杂交液，98℃变性10min，-20℃退火 5min，42℃杂交过夜。      （2）杂交后2×SSC洗10min/3次，1×SSC洗10min/3次      （3）缓冲液洗涤10min，3次；      （4）加AP标记的羊抗地高辛抗体复合物，37℃，2h；      （5）缓冲液洗涤5min，3次；      （6）NBT、BCIP暗处显色，镜下控制，终止显色。      （7）常规脱水：透明、封固。

PCR技术的应用 基础研究： 扩增目的基因和鉴定重组子 克隆基因 基因功能和表达功能研究 基因组测序 制备单链模板 致突变

PCR技术的应用 临床医学： 遗传病诊断 肿瘤癌症诊断 病原体检测 基因分型： PCR-SSOP/PCR-SSCP /RAPD-PCR 法医学： 遗传病诊断 肿瘤癌症诊断 病原体检测 基因分型： PCR-SSOP/PCR-SSCP /RAPD-PCR