流式細胞儀 基本原理與應用 美商必帝股份有限公司

What is Flow Cytometry? 以流體(Flow)來帶動細胞(Cyto)或粒子，對其特性進行檢測(-metry)的一種分析技術。 大小 結構複雜度與顆粒性 細胞膜表面抗原(ligand, receptor, adhesion molecule…etc) 細胞內抗原(cytokine, enzyme, signal transduction molecule…etc) DNA含量 …etc.

Flow Cytometry 之特色 High Speed:可在一分鐘內檢測104〜105 細胞。 以單一細胞為分析基礎 (100-1000/sec) 以單一細胞為分析基礎 可同時進行多參數分析 運用雷射激發，配合各種抗體與染料來染色，並藉檢測特色螢光來辨識及計數細胞。 毋需細胞分離步驟即可篩選出目標細胞進行分析或是加以撿選收集。

What Can a Flow Cytometer Tell Us About a Cell? 它的相對大小 (Forward Scatter—FSC) 它的相對顆粒度或內部複雜度 (Side Scatter—SSC) 它的相對螢光亮度

流式細胞儀的基本組成 液流系統 — 光學系統 — 利用鞘液（FACSFlow Sheath Fluid）將細胞依序送至測量區受檢 光學系統 — 利用雷射光源、透鏡、光柵、濾片與反射鏡等激發並收集細胞產生之螢光與散射光，並導至各探測器內 電子系統 — 1.將探測器測到的光學訊號轉換為電子訊號 2.分析所輸出的電流訊號，以脈衝高度(H)、寬度(W)、積分面積(A)顯示 3.量化並放大訊號傳至電腦

BD FACSCaliburTM 基本桌上型三/四色分析儀

FACS CaliburTM 的液流系統 流動室 螢光 散射光 偵測區 激發光源 樣品流動區 Hydrodynamic Focusing 液流聚焦 流動室

FACS CaliburTM 的光學系統

激發光源 標準配備: 488nm 藍光雷射 Optional: 635nm 紅光雷射 樣品流動區 偵測區 激發光源 散射光 螢光

散射光測量原理 FSC Sensor Laser SSC Sensor

散射光特性 波長與入射光一致，為細胞固有的物理及生理特性，可依此對未染色的細胞進行分析 -- 前向散射光(FSC):與細胞大小有關 -- 側向散射光(SSC):與細胞內部的結構及顆粒性有關

散射光分析圖例 Lysed Whole Blood Neutrophils Side Scatter Monocytes Forward Scatter Side Scatter Lymphocytes Monocytes Neutrophils

螢光激發原理

常見螢光分子Emission Spectra

光學濾片 螢光激發波長依所選螢光染劑而異，可經由不同之光學濾片導至各個探測器內 光學濾片

螢光代表意義 Emitted Fluorescence Intensity Binding Sites FITC FITC FITC FITC FITC FITC FITC FITC FITC FITC Number of Events Fluorescent Intensity

FACS CaliburTM 的光學系統

2-16° Forward Scatter (FSC) FACS CaliburTM 的光學系統 2-16° Forward Scatter (FSC) “Size” 90° Side Scatter (SSC) “Granularity” FITC GFP PE Cy3 PI PerCP PerCP-Cy5.5 PE-Cy7 APC

電子系統 將探測器測到的光學訊號轉換為電子訊號(脈衝) 分析所輸出的電流訊號，以脈衝高度(H)、寬度(W)、積分面積(A)顯示 量化並放大訊號傳至電腦

訊號之產生與處理

訊號之產生與處理

線性--對數之轉換

線性--對數之轉換 基本原則: -- 訊號強弱差<10倍or需線性關係:使用線性放大器(如散射光,DNA分析) -- 訊號強弱差>10倍or需分析弱螢光表現:使用對數放大器(如螢光)

實驗數據之呈現 List-mode

實驗數據之呈現(Histogram Plot)

實驗數據之呈現(Dot Plot)

圈選 (gating) 功能 挑選出有意義細胞族群。 可用來篩選實驗數據。 R1

Review

螢光補償（Compensation）

Emission Spectra

FITC Fluorescence Overlap

FITC Compensation

FITC Compensation

PE Fluorescence Overlap

PE Compensation

PerCP Fluorescence

Compensation Examples

Applications of Flow Cytometry 細胞表面抗原分析（Cell Surface Antigens/Markers） 細胞內抗原分析（Intracellular Antigens） -- Cytokines, Signal Transduction molecules…etc. DNA分析 -- Cell viability, Cell cycle, Apoptosis…etc. 細胞功能參數分析 -- Free radicals, Ca2+, Protein expression (reporter genes) …etc. CBA (Cytometric Bead Array) ……

細胞表面抗原分析 定性分析：陰、陽性界定 定量分析：表面受體因刺激而表達量增強或減弱 Ligand Receptor adhesion molecule …etc 定性分析：陰、陽性界定 定量分析：表面受體因刺激而表達量增強或減弱

淋巴球免疫分型 Whole Blood RBC Leukocyte (CD45+) Platelet Granulocyte Lymphocyte Monocyte (CD14+) T cell (CD3+) B cell (CD19+) NK cell (CD3-, CD16+/CD56+) Helper T cell (CD4+) Cytotoxic T cell (CD8+)

Helper T cell T cell / B cell Suppressor T cell

Permeabilizing solution 細胞內抗原分析 Cytokine Enzyme signal transduction molecule …etc. Permeabilizing solution 定性分析：陰、陽性界定 定量分析：因刺激而表達量增強或減弱

Advantages of Intracellular Flow Cytometry Single cell level Define antigen-secreting cells by combination of surface and intracellular staining Rapid detection

Combination Cell Surface and Intracellular Protein Staining Picture From www.fredonia.edu

Cytokine Profiles of Memory T Cell Subsets

Signal Transduction

Flow Cytometry v.s Western Blot

Comparison

Intracellular Staining in Activated Lysed Whole Blood

DNA 含量分析 Ethanol Detergent Nucleic Acid Dye 細胞週期分析 Apoptosis

DNA 特異性染劑 Propidium Ethidium N+ C2H2)3 NH2 C2H5 CH3 NH2 NH2 N+ C2H5

細胞周期位相的決定 s s M G2 G2 M G0 G0 G1 G1 2N 4N DNA content Count 200 400 200 400 600 800 1000 DNA content

Apoptosis (Sub G1)

細胞功能參數分析 細胞的酵素活性 (Substrates) 細胞膜、粒腺體膜電位 (DiOC6, JC-1) 細胞內氧化代謝物 細胞內酸鹼值 (Snarf-1) Ca2+流動 (Fluo-4/Fura Red, Indo-1) 細胞增殖分析 (PI, BrdU, Intracellular Cyclins) 細胞凋亡研究 (Annexin V, active Caspase-3)

Annexin V Assay

Annexin V/PI 雙染 Early Apoptosis

Cytometric Beads Array (CBA) Single Step Incubation or Two-Step Incubation

Beads Provide a Flexible Platform Multiple sizes Different fluorescence intensities Different colors with different intensities

Advantages of Bead-Based Immunoassays Analyze multiple analytes simultaneously Reduced sample volume requirements Reduced hands-on time by parallel analysis of samples Wide dynamic range of fluorescence detection (requires fewer sample dilutions)

Proteins Measured A. Interleukin (IL)-2 B. IL-4 C. IL-5 D. IL-10 E. Tumor Necrosis Factor-a F. Interferon-g