一、组织的固定 1、凡需要进行病理组织学检查的标本（器官或组织）离体（活体或尸体）后，应尽快置放（浸泡）于装有足够量固定液的容器中固定。固定液量应为被固定标本体积的5一10倍，置放标本的容器大小视标本和固定液的体积而定，应适当大一些。临床科室切取的标本置放于容器中固定后，应尽快送交病理科继续固定。未能及时、充分固定的干涸或腐败标本，不能再进行固定和用于制作切片。

2、常规固定液为10%中性福尔马林（4%中性甲醛）。应预先多量配制贮存，以备随时使用。小标本的固定时间为4一6h，大标本为18一24h或更久。 3、根据病理学特殊检查（特殊染色和组织化学染色、免疫组织化学染色和原位核酸分子杂交染色，电镜观察等）的需要，应选用其它适宜的固定液进行固定。

4、器官、组织固定的基本方法 （1）食管、胃、肠、胆囊、膀胱等空腔器官：依规范方法剪开后，按其自然状态平铺于硬纸板上（重点暴露黏膜面或内表面的病变处），并用大头针将标本边缘处固定于纸板上，然后放入10%福尔马林中固定（黏膜面或内表面朝向容器的液面，并覆盖薄层脱指棉）。

（2）肝、脾：由器官背面，沿其长轴每间隔1. 5一2 （2）肝、脾：由器官背面，沿其长轴每间隔1.5一2.0cm纵向平行剖开，切成数片。将每片肝或脾轻轻地平放于装有10%福尔马林的容器中，容底面衬以脱脂棉。应避免标本弯曲和相互间的叠压。 （3）肺叶：放入固定液中的肺叶漂浮于液面，须在肺表面覆盖浸合固定液的薄层脱脂棉。必要时从支气管注入适量的10%福尔马林。

（4）肾：沿肾外缘中线朝肾门方向做一水平切面（深达于肾盏） 再行固定。 （5）淋巴结：先用10%福尔马林固定1h后，再沿其长轴切开（肿大的淋巴结可切成数片，厚2一3mm）继续固定。 （6）骨组织：先锯成小片（若是长骨应做横向锯片），在10%福尔马林中固定24h后，再进行脱钙。

（7）微小组织或液体沉淀物：先用试纸或滤纸妥为包裹（须用大头针扎牢），然后放入专用小盒内进行固定，以防检材遗失。 凡进入固定程序的标本必须连带其正确无误的患者姓名、性别及病理检验号（病理号）。 5、多数固定液对人体有害，需要防护，必须在封闭的通风条件下进行操作。

6、组织块的切取和固定。 （1）由较大标本切取用于制作切片的组织块（取材）时，应与标本的断面平行，组织块厚度一般为0.3cm（不应>0.5cm）面积一般在1.5～2cm×1.5～2cm.。 （2）切取组织块的形状，在充分包括肉眼所见病变的前提下尽量规则些（例如方形、矩形、三角形等。）

（3）固定组织液的固定液量，一般应为组织块总体积的5一10倍以上。 （4）室内常温（25℃左右）下的固定时间为3一24h；低温（4℃）下的固定时间应延长。 （5）固定组织块的容器要大些。 （6）组织块固定期间需要间断地轻摇或搅动固定液以利于固定液的渗入。

7、常用固定液 （1）4%中性甲醛（10%中性福尔马林）固定液： 甲醛（40%） 100ml 无水磷酸氢二钠 6.5g 磷酸二氢钠 40g 蒸馏水 900nl

(2)乙醇一甲醛（洒精一福尔马林，AF）固定液 甲醛（40%） 100ml 95%乙醇 900nl [说明]一般组织块经乙醇一甲醛固定1一2h后，即可移入95%乙醇内脱水。

（3）Carnoy固定液： 无水乙醇 60ml 氯仿 30ml 冰醋酸 10ml [说明]本液是组织化学染色的常用固定液，组织径Carnoy固定液1一2h后，即可移入95%乙醇中脱水。

二、常规石蜡包埋组织切片 （常规切片）的制备 （一）制备程序 1、水洗 2、脱水 3、透明 4、浸蜡 5、包埋 6、切片 注意事项：组织切片制备及其HE染色过程中使用的乙醇，二甲 苯、石蜡等为易燃、有毒物，必须专人管理，2m以内不得有明火，局部环境应有良好的通风和消防设施。

（二）常规切片的手工操作 1、水洗，用流水冲洗已经固定的组织块30min 2、脱水（常温下） （1）乙醇一甲醛（AF）液固定60～120min （2） 80%乙醇60～120min （3） 95%乙醇Ⅰ60～120min （4） 95%乙醇Ⅱ60～120min （5）无水乙醇Ⅰ30～60min （6）无水乙醇Ⅱ60～120min （7）无水乙醇Ⅲ60～120min

注意事项： （1）未经充分固定的组织不得进入程序； （2）用于脱水的试剂容积应为组织块总体积的5～10倍以上；（3）自低浓度乙醇逐级向高浓度乙醇移进脱水；（4）脱水试剂应及时过滤、更换；（5）较大组织块的脱水时间长于较小者，应将两者分开进行脱水；（6）组织块置于无水乙醇内的时间不宜过长（以免硬化）；（7）丙酮脱水性能强，会使组织块过缩，硬脆，不宜用此替代无水乙醇。

3、透明 （1）二甲苯Ⅰ 20min （2）二甲苯Ⅱ 20min （3）二甲苯Ⅲ 20min

注意事项： （1）二甲苯的容积应为组织块总体积的5一10倍以上；2）组织块在二甲苯中透明时间不宜过长（以防组织硬、脆），并依不同种类的组织及其大小而异；（3）二甲苯应及时过滤更换；（4）组织块经二甲苯适度处理后不显透明时，常提示该组织的固定或脱水不充分，应查找原因并妥善处理。

4、浸蜡 （1）石蜡Ⅰ （56～58℃）60min （2）石蜡Ⅱ （56～58℃）60min （3）石蜡Ⅲ （56～58℃）60min

注意事项：（1）熔化石蜡必须有专人负责，必须在熔蜡箱内或水浴中（70℃）进行，不得用明火加温；（2）熔蜡的容积应为组织块总体积的5～10倍以上；（3）组织块经二甲苯适度透明后方可转入浸蜡过程，应尽可能减少将透明后组织块表面的二甲苯带入熔蜡中；（4）浸蜡时间适宜，过短时浸蜡不充分（组织过软），过长时组织硬脆；（5）熔蜡应及时过滤更换。

5、包埋 （1）先将熔化的石蜡倾入包埋模具中，再用加热的弯曲钝头镊子轻轻夹取已经浸过蜡的组织块，使组织块的最大面或被特别指定处的组织面向下埋入熔蜡中，应将组织块平整地置放于包埋模具底面的中央处。包埋于同一蜡块内的多块细小组织应彼此靠近并位于同一平面上；腔壁、皮肤和粘膜组织必须垂直包埋（立埋）。

注意事项： （1）应将组织块严格分件包埋。包埋时一定要首先认真核对组织块的病理号（包括次级号）块数和取材医师对包埋面的要求，准确地置入相应的病理号小条。发生包埋差错时必须立即与取材医师和当班负责人取得联系及时处理。

（2）必须严防各种异物污染，勿将无关组织如缝线，纸屑或其他异物（尤其是硬质异物）埋入蜡块内。（3）包埋过程要操作迅速，以免组织块尚未埋妥前熔蜡凝固。（4）包埋用的熔蜡应纯净，熔点适宜。浸蜡Ⅰ可用软蜡（熔点为45～50℃）浸蜡Ⅱ、Ⅲ和包埋用蜡均用硬蜡（熔点为56～58℃）。

（5）包埋用熔蜡使用前应先静置沉淀、过滤。（6）熔蜡时不得使用明火，以防燃烧。包埋用熔蜡的温度应<65℃，包埋用的镊子不可加温过高，以免烫伤组织。

6、切片 （1）切片刀或一次性切片刀必须锋利。使用切片刀时，必须精心磨备（在低倍显微镜下确认刀刃无缺口）；使用一次性切片刀时应及时更新。 （2）载玻片必须洁净、光亮。 （3）将切片刀或刀片安装在持刀座上（以15℃为宜）。

（4）将蜡块固定于支持器上，并调整蜡块和刀刃至适当位置（刀刃与蜡块表面呈5℃夹角为宜）。 （5）细心移动刀座或蜡块支持器，使蜡块与刀刃接触，旋紧刀座和蜡块支持器。 （6）修面（粗切）。用右手匀速旋转切片机轮，修切蜡块表面至包埋其中的组织块完整地全部切到。修切粗切片的厚度为15～20微米。

（7）调节切片厚度调节器（一般为4～6微米），进行切片。切出的蜡片应连续成带状，完整无缺，厚度适宜（3～5微米），均匀、无刀痕、颤痕、皱褶、开裂、缺损、松解等。 （8）以专用小镊子轻轻夹取完整、无刀痕、厚薄均匀的蜡片，放入水温45℃左右的水浴中进行展片，使切片全面展开（注意：必须水温适宜，洁净，每切完一个蜡块后，必须认真清理水面，不得遗留其它病例的组织碎片，以免污染）。

（9）将蜡片附贴于载玻片右（或左）2/3处的中央，留出载玻片左（或右）1/3的位置用于贴附标签。（如果特殊组织或有特殊要求的事先在载玻片上涂摸蛋白甘油或经3—氨丙基—三乙氧基硅浣处理过的载玻片），蜡片与载玻片间应无气泡。

(10)必须立即在置放了蜡片的载玻片一端(待贴标签的一端),用优质记号笔或刻笔准确、清楚地标记其相应的病理号。（包括次级号），（注意：必须确保载玻片上的病理号与相关组织石蜡包埋块的病理号完全一致，不得错写或漏写病理号）。

（11）将置放了蜡片的载玻片呈45℃斜置片刻，待载玻片上的水分流下后， （11）将置放了蜡片的载玻片呈45℃斜置片刻，待载玻片上的水分流下后， 将其置于烤片仪（60～65℃ 10～20min）或烤箱中烘烤（60℃30～60min）后方可进行染色。 注意事项。（1）组织块固定、脱水、透明和浸蜡的质量直接影响切片制备。切片过程中遇到的困难首先应注意从切片前的上述各环节中寻找原因。

（四）常规切片的自动组织处理机操作 步骤的次序和各步骤的持续时间，总计需要14h。 1、乙醇一甲醛（AF）固定液2×60min 2、95%乙醇Ⅰ 2×60min 3、95%乙醇Ⅱ 60min 4、无水乙醇Ⅰ 60min

5、无水乙醇Ⅱ 60min 6、无水乙醇 Ⅲ 60min 7、二甲苯Ⅰ 30min 8、二甲苯Ⅱ 30min 9、石蜡Ⅰ 30min 10、石蜡Ⅱ 60min 11、石蜡Ⅲ 90min

12包埋 （1）手工常规包埋见上文。 （2）用组织包埋机时，按有关厂商说明书的规定操作。 注意事项：（1）必须按有关说明书的规定，使用和维护自动组织脱水机。（2）要严防因停电、机械故障等造成的组织块损坏，一旦发生此类事故，必须及时向病理科主任报告，尽快采取应急措施妥善处理。

（3）使用自动组织脱水机时：A、合理设定运行时间（充分利用夜间）。B、固定、脱水的环境温度不得>30℃。C、乙醇、二甲苯和熔蜡的容积，要大于组织块总体积的5一10倍以上，并应经常过滤、保持清洁，应经常检查试剂的浓度，及时更新。D、对于多量组织块可按其大小分批进行处理，小块组织可适当缩短处理时间。

三、快速石蜡包埋组织切片的制备 快速石蜡包埋组织切片的方法较多，比如煮沸固定切片法，超声波快速处理仪石蜡切片法、加温手工处理切片法等，最常见的还是加温手工处理切片法。 1、固定、切取组织大小不得>5mm，厚度<2mm。固定时间30～60min。加温60℃固定时间10～20min。

2、脱水需放在60℃烤箱中 （1）85%乙醇5～10min （2） 95%乙醇Ⅰ5～10min （3） 95%乙醇Ⅱ5～10min （4）无水乙醇Ⅰ5～10min （5）无水乙醇Ⅱ5～10min （6）无水乙醇Ⅲ5～10min

3、透明（需放在60℃烤箱中） (1) 二甲苯Ⅰ 5 min (2)二甲苯Ⅱ 5～10min 4、浸蜡 (1)石蜡Ⅰ 10～15min (2)石蜡Ⅱ 10～15min (3)石蜡Ⅲ 10～15min 5、包埋、包埋方法见前文

注意事项： （1）为了尽快缩短时间，必须预先做好有关准备工作，各部试剂提前预热。（2）用于组织、固定、脱水、透明的试剂和浸蜡用的石蜡应及时过滤，更换，保持有效浓度及洁净。（3）以上各种试剂均为易燃物，进行上述各项流程时两米距离内不得存在明火。

四、冷冻组织切片的制备 （一）恒冷箱切片机制备切片 是目前最适用方法。恒冷箱切片机和种类较多，应严格按有关厂商的说明书操作。用于切片的组织必须未曾固定。

（二）开放式冷冻切片机制备切片 １、二氧化碳制冷切片 （１）将组织块放在冷冻台上，滴加ＯＣＴ或羟甲基纤维素液于组织块周围（将组织块包埋），使固定在切片机上的切片刀接近组织表面。 （２）间断开放液态的二氧化碳桶的开关，喷冻组织块和切片刀，使组织块冻结和切片刀制冷。

（３）迅速移动切片刀进行切片，先将组织块修平，然后调节厚度至８～12微米进行切片。 （4）用毛笔将切片展开，贴附于载玻片上，稍干后，置于冷冻切片固定液中固定1min，随即进行HE染色。 （5）组织块也可先在10%福尔马林中煮沸固定1min，水洗后再行冷冻切片。

2、半导体致冷切片 1）、切片刀与持刀器之间要间隔一层云母片或硬纸片。将冷刀制冷器粘在刀面上。 （ 1）将组织冷冻台安装在半导体切片机上。 （2）将冷冻台和切片刀制冷器上的导线连接在控制台直流电源上（注意：正负电极不可接反）。

（3）连接制冷器的冻却水管并开始放水，然后开启电源，冷却水管中的水流量不宜过大，在使用过程中不得断水。 （4）调整冷冻温度调节器，至切片刀和冷冻台呈现霜冻。 （5）将新鲜组织块或已固定的组织放在冷冻台中央，滴加水或OCT或用水调及糊状的羟甲基纤维素于组织块周围（将组织块包埋）。

（6）待组织块冷冻适当后进行切片。 （7）对于未经固定的新鲜组织，用毛笔将制作满意的切片展平，立即裱贴于盖玻片或载玻片上，待冷冻切片刚要融化时，立即固定1min。对于已经固定的组织块，可用毛笔将制作满意的切片托入水中展平，再用玻璃弯针将切片移至染色皿中进行染色。 （8）切片完毕后，先关闭电源，再关闭冷却水，待冰霜融化后擦干机器，加罩。

3、氯乙烷制冷切片 （1）将新鲜的或已固定的组织块置于支持器中央，加少许水或OCT。 （2）连继喷射氯乙烷于组织上，待组织块冷结后，即为间歇喷射，使冷冻适度，立即切片，使用氯乙烷时应注意防火，防暴。 （3）进行组织切片的裱贴、固定和染色（与上述方法相同）。

注意事项： （1）冷冻切片所需的试剂和设备等应处于随时可供的使用状态。（2）切取的组织块大小适宜（厚度<2mm），并尽快置于冷冻组织切片机上制备切片。（3）调节冷冻程度，试切合适时便迅速切片。冷冻不足无法切片，冷冻过度切片易碎。

4、冷冻切片固定液。 （1）乙醚一乙醇液：无水乙醚1份 95%乙醇 1份。 （2）乙醇冰醋酸液：95%乙醇100ml 冰醋酸3～5滴。 （3） 10%中性福尔马林液。

五、骨组织脱钙方法 骨和其它钙化组织，通常需要脱去钙盐后进行切片。骨组织脱钙前先行固定。 （一）常规脱钙法 1、将骨组织锯成薄片（约1cm×1cm×0.3cm）。 2、在AF液中或10%福尔马林液中固定6～12h。

3、将骨片置于5%硝酸（急需时可置于37℃温箱）中脱钙，至用针轻刺可进入时为止，需12～24h，其间可更新脱钙液2～3次。 7、按常规脱水，石蜡包埋。

（二）电解脱钙法 将骨片置于装有8%硝酸和10%甲酸混合液的电泳槽内的阳极处，6v直流电源下持续电解30min至3h，至用针轻刺可入时为止。 （三）骨髓组织脱钙 可浸泡于苦味酸饱和液（占85%）甲醛（占10%）和冰醋酸（占5%）的混合液中同时进行固定和脱钙。

注意事项： （1）骨片等脱钙组织的厚度适宜。（2）脱钙组织与脱钙液的体积比>1：30。（3）脱钙过程中应不时摇动，多次更换脱钙液。 （4）脱钙时间不可过长。（5）微波处理可加速脱钙过程。（6）脱钙后的组织必须用流水充分冲洗。（7）用于包埋的石蜡硬度适中（不要过软或过便）。

六、苏木素—伊红（HE）染色 HE染色是应用最广泛的组织病理学常规染色技术。 （一）染色程序 1、石蜡切片HE染色 （1）二甲苯Ⅰ 5～10min。 （2）二甲苯Ⅱ 5～10min。 （3）无水乙醇Ⅰ 1～3min。

（4）无水乙醇Ⅱ 1～3min。 （5） 95%乙醇Ⅰ 1～3min。 （6） 95%乙醇Ⅱ 1～3min。 （7） 80%乙醇 1min。 （8）蒸馏水或自来水洗1min。 （9）苏木素染色 5 ～10min。

（10）流水洗去多余的苏木素液 1min。 （11） 1%盐酸乙醇分化 1～3S。 （12）稍水洗 1～2S。 （13）自来水返蓝（用温水或1%氨水返蓝更快） 5- 10S。 （14）流水冲洗 5min或更长时间。 （15）蒸馏水洗 1～2min。 （16）伊红染色 1～3min。 （17）蒸馏水稍洗1～2S。

（18）80%乙醇 1～2S。 （19） 95%乙醇Ⅰ 2～3min。 （20） 95%乙醇Ⅱ 2～3min （21）无水乙醇Ⅰ 3～5min （22）无水乙醇Ⅱ 3～5min。 （23）二甲苯Ⅰ 3～5min （24）二甲苯Ⅱ 3～5min。 （25）二甲苯Ⅲ 3～5min. 上述（12）和13项可省去，但（14）项冲水时间应延长，（细胞核显示更清晰）。

2、冷冻切片HE染色。 （1）10%中性福尔马林固定10～30S。 （2）无水乙醇 10～30S。 （3）稍水洗 1～2S。 （4）苏木素染色 3～5min. （5）水洗 5～10S。 （6） 1%盐酸乙醇分化 1～3S。 （7）水洗 1～2min。

（8）返蓝（用温水或1%氨水等）5～10S。 （9）流水冲洗15～30S。 （10）伊红染色 1～2min。 （11） 80%乙醇 1～2min. （12） 95%乙醇 1～2min。 （13）无水乙醇Ⅰ 1～2min （14）无水乙醇Ⅱ 1～2min。 （15）二甲苯Ⅰ 2～3min （16）二甲苯Ⅱ 2～3min。 （17）中性树胶封固。

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