酶分离纯化的一般原则 酶纯化的基本步骤 酶纯化的常用方法

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酶分离纯化的一般原则 酶纯化的基本步骤 酶纯化的常用方法 酶的分离与纯化分析 酶分离纯化的一般原则 酶纯化的基本步骤 酶纯化的常用方法

酶的纯化过程 1、建立一个适当的测活方法 2、酶源选材要以含酶丰富、取材方便、经济为原则 3、酶的提取 4、酶的提纯 5、酶的纯度检验

一、酶的提取 1、生物组织的破碎 (1)机械(匀浆)法 (2)超声波法 (3)冻融法 (4)渗透压法 (5)酶消化法

2、抽提 典型的抽提液由以下几部分组成: 抽提液 = 离子强度调节剂 + pH缓冲剂 + 温度效应剂 (KCl、NaCl、蔗糖) (各种缓冲液) (甘油、二甲基亚砜) + 蛋白酶抑制剂 + 防氧化剂 + 重金属络合剂 +增溶剂 (PMSF、DIFP) (DTT、巯基乙醇) EDTA、柠檬酸 (TritonX-100) 通常都用0.3mol/L的蔗糖溶液或0.15mol/LKCl溶液抽提。

3 蛋白質抽取 如何開始? 5W 基本原則 材料來源: 材料取得與保存 均質及抽取: 確實做好第一步 鹽析及沉澱法: 最經濟方便方法

二、酶的提纯 酶的提纯手段一般都是依据酶的分子大小、形状、电荷性质、溶解度、专一结合位点等性质而建立的。要得到纯酶,往往需要将各种方法联合使用。

常用的提纯方法

酵素的純化過程 可分為三個階段: (1) 粗蛋白質 (crude protein)︰ 採樣 → 均質打破細胞 → 抽出全蛋白,多使用 鹽析沉澱法;可以粗略去除蛋白質以外的物質。 (2) 部分純化 (partially purified)︰ 初步的純化,使用各種 管柱層析法。 (3) 均質酵素 (homogeneous)︰ 目標酵素的進一步精製純化,可用 製備式電泳 或 HPLC。

                                                                                     酶的纯化及分析方法

鹽析沉澱法可分離出樣本中的蛋白質。 蛋白質在水溶液中的 溶解度,會因溶液中其它鹽類濃度的改變而增減,可利用來沉澱蛋白質。 其原理是因於蛋白質分子表面電荷的改變,或者分子上 極性 或 非極性 區域與水分子間作用結果。

■ 盐浓度對蛋白質溶解度的影響: ● 鹽溶 Salting-in: ● 鹽析 Salting-out: 加鹽使蛋白質溶入水溶液中 加鹽使蛋白質由水溶液中沉澱出來

設計純化步驟時,需考慮下列各項要求 a. 高活性 b. 高回收率 c. 高純度 d. 方便與快速

組合純化步驟 a. 組合標準 (1) 已知的酵素,可依照已發表的步驟進行,有問題再作改進。 通常都是以 硫酸銨分劃 - 膠体過濾 - 離子交換 為骨幹,再加上其它方法,組成全部流程。 (2) 對完全未知的酵素,可循此骨幹先試行純化,看其結果如何再加改進。 (3) 不要忘記利用該酵素的特殊性質來純化,如在其 pI 沉澱性、特別的疏水性、有專一的抑制劑或熱穩定性等。

近朱者赤、近墨者黑,物以類聚,不論人類或是分子皆同

色谱的类型

. 常用的層析方法

膠體過濾法 膠体過濾 属 partition 層析法,流動相為溶離緩衝液,固定相為膠体孔隙內的緩衝液。 溶質 (樣本蛋白質) 根據其 分子量 的大小,決定分佈在這兩相的比例。 分子量大的不易進入膠球,隨流動相溶離;分子量小的,則易竄入膠球內的固定相,而被延滯流出膠柱 。 分子的 形狀、大小 均為影響因素,即與其 分子半徑 (Stokes radius) 有關,與分子量不完全成正比關係;但一般均視蛋白質為球形,故其形狀較無影響力。 

膠体過濾法在操作時,有些內在的問題,會影響結果的好壞: (1) 擴散及亂流: 由於是在液相中進行,樣本在膠柱中的 擴散現象 相當顯著;又因液体在膠球間流動時,受 重力 及 對流 的影響,會造成 亂流。 擴散及亂流都會使膠体過濾的解析力降低甚多。 (2) 管柱設計不良: 經常是致命的傷害,例如 無效空間 (dead volume) 過大、緩衝液進入膠体時流動不均、溶離液出口端的管路太長或太粗等。

管柱操作 单击显示 管柱操作的详细步骤

離子交換法 離子交換法 乃利用分子的帶電性質進行分離,解析力好且具多樣性,是重要而應用極廣的純化方法。 原理概述 a. 離子交換法   離子交換法 乃利用分子的帶電性質進行分離,解析力好且具多樣性,是重要而應用極廣的純化方法。   原理概述  a. 離子交換法 是一種 adsorption 層析法,流動相為溶離緩衝液,固定相為介質擔体表面的帶電基團。 樣本中各種離子,與介質表面帶電基團間的親和力強弱不同,吸附上去之後,可使用不同離子濃度的緩衝液,分別溶離出這些成分

■ 環境影響分子的帶電性質

b. 兩大類離子交換介質 由介質帶電基團的不同,可分為兩大類: 介質-帶電基團 (counter ion) (1) 陽離子交換介質 (cation exchanger):      擔体-陰離子基團 ..... 陽離子  (2) 陰離子交換介質 (anion exchanger):       擔体-陽離子基團 ..... 陰離子 

色層焦集法 樣本蛋白質進入色層焦集管柱後,先遇到較高 pH 環境 (介質),通常高於其 pI 而帶負電,因此會結合到介質上。 當 Polybuffer 開始注入管柱,降低環境 pH,使樣本分子失去負電荷而溶離下來;蛋白質便依 pI 大小順序,pI 高的先溶離出來;同時會集中在其 pI 的地方,成為一條極細色帶,故稱為焦集法。

■ 專一性結合力量的構成因素: II. Interaction Forces: I. Conformational Match: (1) Hydrogen bond (2) Hydrophobic interaction (3) Electrostatic interaction (4) Van der waals interaction I. Conformational Match: Van der waals interaction

■ 典型的親和層析操作:

■ 以親和層析法純化 Trypsin:

HPLC 與 FPLC HPLC 為 高效能液相層析法 (high performance liquid chromatography) 之意;也有說是 high pressure,因為要使用高壓推動溶離液,以加速層析過程。 FPLC 則不用高壓,但流洗速度也很快 (fast performance),是因為所用的介質通透性極高之故。用於 adsorption 型式的層析法,例如以離子交換分離各種胺基酸等小分子。 近來由於介質材料的發展,各種應用在大分子的液相層析法,均可 HPLC 的方式來進行;不但加快分析速度,也使解析度提高很多。 除了上述的離子交換法外,還可用在膠体過濾法、逆相層析法或親和層析法; HPLC 及 FPLC 系統,將來有可能取代傳統的低壓慢速液相層析法。

三 总结 单击显示 酶分离、纯化及分析实验分步指导