PCR常见问题、原因分析及其对策

主讲内容 PCR技术简介 PCR技术简介 PCR常见问题、原因分析及其解决方案 提高PCR反应特异性的策略

PCR标准反应体系 DNA模板 引物 反应缓冲液 dNTP ddH2O 耐热聚合酶

反应体系对PCR扩增的影响 DNA模板 引 物 纯度 蛋白、多糖、酚类等杂质会抑制PCR反应 完整性 模板降解会导致PCR扩增无产物 浓度 加量过多导致非特异性扩增增加 特异性 长度适当、避免二级结构和二聚体 完整性 避免反复冻融 浓度 应适当,过高导致非特异性增加,过低则 引 物 扩增产物太少

反应体系对PCR扩增的影响 反应Buffer pH值,盐离子浓度 Mg 2＋浓度 稳定剂,增强剂 过高非特异性严重 过低无扩增产物 浓度适当 避免反复冻融 dNTP Mixture pH值适当 避免污染 ddH2O

PCR标准反应体系 DNA模板 引物 反应缓冲液 Mg 2＋ dNTP ddH2O 耐热聚合酶

如何选择最合适的DNA聚合酶 DNA 聚合酶的特性 PCR 实验的不同需求

如何选择最合适的DNA聚合酶 －－ DNA 聚合酶的特性 纯 度 稳定性 酶活性

如何选择最合适的DNA聚合酶 －－ PCR 实验的不同需求 特 异 性 保 真 性 长片段扩增 扩增效率 PCR试剂盒 基因组扩增、RT-PCR 保 真 性 基因筛选、测序、 基因克隆 长片段扩增 构建基因图谱、测序、分子遗传学 基因组扩增（较高灵敏度和特异性） 扩增效率 复杂模板扩增（GC含量高、二级结构） PCR试剂盒 复杂模板扩增、大规模基因检测

－ 热启动 Taq酶 原 理 特 点 用 途 特异性 蜡封 抗体抑制 化学修饰 避免非特异性扩增 提高PCR反应的 基因组扩增 RT-PCR

－ 热启动 Taq酶 特异性 大大提高PCR反应的特异性 化学修饰 化学修饰不影响后续实验 抗体抑制 蜡封 产 品 类 型 产 品 名 称 产 品 性 能 化学修饰 天为时代: HotStart Taq Roche : FastStart Taq Abgene: Thermo-start® DNA Polymerase Stratagene: SureStart™ Taq 大大提高PCR反应的特异性 化学修饰不影响后续实验 抗体抑制 Invitrogen： AccuPrimeTM Taq Platinum® Taq TaKaRa： ExTaqTM HotStart Version 蜡封 Promega：TaqBeadTM HotStart

— 高保真酶 原 理 用 途 保真性 3’－5’核酸 外切酶活性 降低碱基错配率 表达基因的克隆 基因的定点突变 细胞内基因点突变分析（SNP）

— 高保真酶 保真性 在目前已发现的所有耐热聚合酶中, Pfu保真度最高碱基错配率最低 Pfu 天为时代 DNA Polymerase 产 品 类 型 生 物 公 司 性 能 比 较 Pfu DNA Polymerase 天为时代 Stratagene Promega 在目前已发现的所有耐热聚合酶中, Pfu保真度最高碱基错配率最低 PyrobestTM TaKaRa Tli

高保真 ＋ 高扩增效率 原 理 用 途 混合酶 －高扩增效率 超长片段扩增 复杂模板扩增 － 3’－5’核酸外切 －构建基因图谱 高保真 ＋ 高扩增效率 原 理 用 途 混合酶 －高扩增效率 － 3’－5’核酸外切 超长片段扩增 －测序 －构建基因图谱 复杂模板扩增 －GC含量高 －二级结构

高保真 ＋ 高扩增效率 高扩增效率 保真度低于Pfu聚合酶 高保真 但扩增效率较高 特别适用于保真度较高的 超长片段扩增 特 点 产 品 高保真 ＋ 高扩增效率 特 点 产 品 性 能 高扩增效率 天为时代：Taq Plus TaKaRa：Ex TaqTM 复杂模板扩增 高保真 天为时代： Taq Platinum Invitrogen：Pfx Platinum Taq High Fidelity 保真度低于Pfu聚合酶 但扩增效率较高 长片段扩增 天为时代：Long Taq TaKaRa：LA Taq Invitrogen：Elongase Amplificaiton System 特别适用于保真度较高的 超长片段扩增

PCR MasterMix 原 理 预配好的PCR反应液 DNA聚合酶 反应缓冲液 dNTP PCR增强剂

PCR Master Mix 特 点 适用范围 大规模基因检测 目的基因拷贝数极低的样本 GC含量高,有二级结构的模板 复杂基因组样本 快速简便 减少加样误差和污染 灵敏度高 可扩增低至2个拷贝的目的模板 特异性强 降低PCR反应的要求，增强特异性 稳定性好 长期放置活性无改变 适用范围 大规模基因检测 目的基因拷贝数极低的样本 GC含量高,有二级结构的模板 复杂基因组样本 可直接检测菌落，基因点突变检测, 或者阳性克隆的筛选。

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PCR常见问题 无扩增产物 非特异性扩增 拖尾 假阳性

PCR常见问题之一 无扩增产物 现象：正对照有条带，而样品则无； 对 策 原因 模板:含有抑制物，含量低 Buffer对样品不合适 引物设计不当或者发生降解 反应条件：退火温度太高，延伸时间太短 纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量 更换Buffer或调整浓度 重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物 降低退火温度、延长延伸时间 对 策

PCR常见问题之二 非特异性扩增 现象：PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。

PCR常见问题之二 非特异性扩增 对 策 原因 重新设计引物或者使用巢式PCR 适当降低模板或引物浓度 适当减少酶量 降低镁离子浓度 适当提高退火温度或使用二阶段温度法 减少循环次数 引物特异性差 模板或引物浓度过高 酶量过多 Mg2+浓度偏高 退火温度偏低 循环次数过多 对 策

PCR常见问题之三 拖尾 现象：产物在凝胶上呈Smear状态。 M 1 2

PCR常见问题之三 拖尾 对 策 原因 模板不纯 Buffer不合适 退火温度偏低 酶量过多 dNTP、Mg2+浓度偏高 循环次数过多 纯化模板 更换Buffer 适当提高退火温度 适量用酶 适当降低dNTP和镁离子的浓度 减少循环次数 对 策

假阳性（筛选转基因、检测基因表达情况) PCR常见问题之四 现象：空白对照出现目的扩增产物 原因：靶序列或扩增产物的交叉污染 对策： 操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外； 除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。 各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。

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四种策略 巢式PCR（Nest-PCR） 递减PCR（TouchDown PCR） 热启动PCR（HotStart PCR）

策略之一 巢式PCR（Nest-PCR） 巢式PCR的使用降低了扩增多个靶位点的可能性，因为同多套引物都互补的靶序列很少。 P4 P2 P1 巢式PCR可以增加有限量靶序列（如稀有mRNA）的灵敏度，并且提高了困难PCR（如5' RACE）的特异性。

策略之二 递减PCR（TouchDown PCR） 递减PCR通过在PCR的前几个循环使用严谨的退火条件提高特异性。循环设在比估算的Tm高大约5℃的退火温度下开始，然后每个循环降低1-2℃,直到退火温度低于Tm 5℃。 特异性最高的目的模板会被优先扩增，这些产物在随后的循环中继续扩增占据优势。 递减PCR对于那些不了解引物和目的模板同源性程度的方法更为有用，如AFLP、DNA指纹分析等。

策略之三 热启动PCR （HotStart PCR） 热启动主要是通过抑制一种基本成分延迟DNA合成，直到PCR 仪达到变性温度； 现在有很多公司都有HotStart Taq酶出售，该酶具有热启动的性能，使用简单方便，适合于高通量应用； 热启动PCR是除了好的引物设计之外，提高PCR特异性最重要的方法之一。

策略之四 使用PCR增强剂 甲酰胺，DMSO，甘油，甜菜碱等都可充当PCR的增强剂。 其可能的机理是降低熔解温度，从而有助于引物退火并辅助DNA聚合酶延伸通过二级结构区。 增强剂浓度要适当

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