色谱联用技术 1. 概述 2. 气相色谱-质谱联用技术 3. 液相色谱-质谱联用技术 4. 毛细管电泳-质谱联用技术

□ 定义 1. 概述 将两种色谱法或色谱法与光谱法联用的方法，称为色谱联用技术。 □ 分类 色谱-色谱联用 ——提高分辩能力 色谱-光谱联用 ——提高定性鉴定能力 □ 当今分析领域中复杂样品最重要的分离分析方法。

1.1 色谱-色谱联用技术 两种色谱法的联用技术, 也称为多维色谱法。 主要目的: 提高色谱系统的分辨能力与增加峰容量。 可分为: 二维薄层色谱法（2D-TLC，或称多向展开） 气相色谱-薄层色谱联用（GC-TLC） 气相色谱-气相色谱联用（GC-GC） 高效液相色谱-高效液相色谱联用（HPLC-HPLC） 高效液相色谱-气相色谱联用（HPLC-GC）

1.1 色谱-色谱联用技术 气相色谱-气相色谱联用技术 （GC-GC） 可分为两类：两种色谱柱的柱切换技术和全二维气相色谱法（GC×GC）。 高效液相色谱-高效液相色谱联用技术 （HPLC-HPLC） 通过柱切换技术将不同性能的色谱柱串联，其目的是改善分离效果、富集被测组分。

气相色谱-傅里叶变换红外光谱联用（GC-FTIR） 1.2色谱-光谱联用技术 气相色谱-傅里叶变换红外光谱联用（GC-FTIR） 气相色谱-质谱联用（GC-MS） 高效液相色谱-紫外吸收光谱联用（LC-UV） 高效液相色谱-质谱联用（LC-MS） 高效液相色谱-核磁共振波谱联用（LC-NMR） 毛细管电泳-质谱联用（CE-MS）等。

GC-MS联用技术 hyphenated technology of GC-MS 2. 气相色谱-质谱联用技术 GC-MS联用技术 hyphenated technology of GC-MS

2.1 GC-MS 联用仪的工作原理 图 GC-MS联用仪组成

接口是解决联用的关键部件, 起到传输分离组分，匹配两者工作流量(即工作气压)的作用。由于高分辨细径毛细管的广泛使用, 常用 “直接导入型接口”。 毛细管柱直接导入型接口示意图

混合物样品注射到气相色谱仪的气化室中, 气化的样品由载气(常用氦气)带入色谱柱, 分离后的组分随载气通过接口进入MS离子源。 2.2 GC-MS联用仪的工作原理 混合物样品注射到气相色谱仪的气化室中, 气化的样品由载气(常用氦气)带入色谱柱, 分离后的组分随载气通过接口进入MS离子源。 组分电离后，分子离子和碎片离子在质量分析中进行质量分离,然后被离子检测器检测。 当质量分析器作一次质量数扫描时，即检测到离子流强度随质荷比而变化的质谱图。

⑴ 全扫描(SCAN) — 通用性检测器 计算机采集数字化的一组组原始数据，一边存储，一边将每次扫描的离子流求和获得总离子流(total ion current, TIC)。随进入离子源组分的变化，总离子流随之变化，总离子流随色谱时间而变化的谱图称为总离子流色谱图(total ion chromatogram)。 在总离子流色谱图上，纵坐标表示总离子流强度，横坐标表示时间，或连续扫描的次数(即扫描图编号数)。 全扫描结束后，可从计算机中调出总离色流色谱图和任何一个保留时间的质谱图。全扫描工作方式适用于未知物的定性分析。

(2) 选择离子监测 (selected ion monitoring, SIM) — 选择性检测 对目标化合物的定量分析, 可提高分析的灵敏度。 把质量分析器调节只传输某一个或某一类目标化合物的一个或数个特征离子, 监测色谱过程中所选定质荷比的离子流随时间变化的谱图（即质量离子色谱图）的方法。 一个色谱流程内可寻找若干个目标物,这样可选择数组特征离子,用时间编程进行监测。 采用SIM得到的色谱图叫选择离子色谱图。

(3) 优点 GC-MS法是在各种联用技术中最成熟的方法。就其应用范围来说，GC-MS法与GC法基本相同，但质谱法固有的优点扩大了其应用范围 。 定性能力强 提供结构信息 可分析色谱尚未分离的组分 高性能检测器：灵敏通用 (全扫描方式)；专属性好（选择离子监测）

3. 液相色谱-质谱联用技术 集液相色谱的高分离能力与质谱的高灵敏度、极强的定性专属性于一体; ▲ LC-MS 是以HPLC 为分离手段，以质谱为鉴定工具的分离分析方法;给出准分子离子及碎片离子的大量信息，大大提高了对组分的鉴定能力; 集液相色谱的高分离能力与质谱的高灵敏度、极强的定性专属性于一体; 广泛应用于药物、化工、临床医学和分子生物学等诸多领域的分离分析。

Finnigan LCQ HPLC-MS仪

3.1 仪器组成和工作原理 样 品 液相色谱仪 接 口 质量分析器 数据处理 真空系统 LC-MS联用仪组成的框图

⑴ 液相色谱系统 要求液相色谱泵能在较低流速下提供流量准确、稳定的流动相，以保证实验结果的稳定性和重现性。 色谱柱通常用的反相ODS柱，一般为10~50 mm的短色谱柱，以缩短分析时间。 对流动相的要求，不能含有非挥发性盐类（如磷酸盐缓冲液和离子对试剂等），挥发性电解质（如甲酸、乙酸、氨水等）的浓度也不能超过10 mmol。低浓度电解液和高比例有机相容易获得较好的离子化效率。

⑵ 接口和离子化方式 各种接口技术的相对适用范围

①电喷雾离子源（ESI） 毛细管 液相入口 雾化针 加热氮气 雾化气入口 锥 孔 +

利用反应气离子与样品分子发生分子－离子反应（质子转移），而使样品离子化。 CI源工作原理：在离子源内充满一定压强的反应气体，如甲烷，异丁烷，氨气等；轰击电子(70 eV)使反应气电离，生成大量的反应气离子，反应气离子再与试样分子碰撞发生离子-分子反应，经过质子交换使试样分子电离，形成准分子离子[M+H]+或[M-H ]+和少数碎片离子。 与EI比较：都是用70eV能量的轰击电子束，但CI多了一个反应气装置，70 ev能量的电子首先与反应气作用，反应气离子再与分子反应， EI 轰击电子是直接与样品分子作用。

ESI可用于在溶液中能以离子形式存在的化合物，因此适用于大多数化合物的定性和定量研究。 可用于分析任何能在溶液中预先形成离子的极性化合物，“预先形成的离子”也包括加合离子。 例如，可在含醋酸铵的溶液中分析聚乙二醇等多聚物，因为溶液中的NH4+离子可与聚合物中的氧原子形成加合物。 由于检测多电荷离子，使得质量分析器检测的质量可提高几十倍甚至更高，ESI可用于分析相对分子质量高达200,000 u的化合物。

② 大气压化学离子化源 (APCI) 利用反应气离子与样品分子发生分子－离子反应（质子转移），而使样品离子化。 在离子源内充满一定压强的反应气体，如甲烷，异丁烷，氨气等；轰击电子 (70 eV) 使反应气电离，生成大量的反应气离子，反应气离子再与试样分子碰撞发生离子-分子反应，经过质子交换使试样分子电离，形成准分子离子[M+H]+或[M-H ]+和少数碎片离子。 与EI比较：都是用70eV能量的轰击电子束，但多了一个反应气装置，70 ev能量的电子首先与反应气作用，反应气离子再与分子反应， EI 轰击电子是直接与样品分子作用。

特 点： 将溶液中的样品分子转化为气态离子。 APCI可使极性较弱或部分非极性的小分子化合物离子化。 在正离子方式下，样品的离子化过程是起源于电子引发的正离子生成，经过初级离子形成、次级离子形成和加合离子形成三个阶段。 在负离子方式下，样品的准分子离子 ( M-H) - 一般是通过OH-离子争夺质子而形成。

以反应气体甲烷为例：生成CH5+离子，CH5+ 离子再与待测分子M发生下述离子-分子反应，形成 [M+H] + ： 反应气离子： 待测样品离子： 准分子离子[M+H] +

(3) 质量分析器 在离子源中生成的各种不同的离子，需要按其质荷比（ m/z ）值大小进行分离，然后依次进入检测器。离子按m/z值分离的过程是在质量分析器实现。 质量分析器：是将来自离子源的离子按其质荷比（ m/z ）值大小进行分离的装置。 质量分析器是质谱计的核心。一台质谱计可以配置多种电离源，却只配有一种质量分析器。

单聚焦质量分析器 离子源出口处有一加速电极，与离子源之间加有电位差V，形成加速电场，离子受加速电场作用获得动能进入磁场作匀速圆周运动。不同m/z值的离子有不同的运动半径R（偏转R ），通过连续改变磁场强度或加速电压，使离子按m/z值大小顺序进入检测器，达到分离。磁场不但使 m/z不同的离子分离还使发散的离子聚在检测器的狭逢处，所以称离子运动半径R、磁场强度H、加速电压V 、离子m/z之间关系符合质谱方程式。

单聚焦质量分析器 26

双聚焦质量分析器 单聚焦磁场分析器分辨率低的原因是离子源中的离子所具有的能量是有微小差别的，受相同的V加速后运动速度不完全相同，这种离子动能的发散影响MS计的分辨率。 双聚焦磁场分析器特点：在离子源和磁场之间加一个静电场，静电场与磁场加一个狭缝，固定了轨道曲率半径R，使通过狭逢进入磁场的离子动能一致，提高了分辨率。静电场的这种作用称为能量聚焦的作用。

离子源 收集器 磁场:方向聚焦 电场：能量聚焦 S1 S2 + - 在离子源和磁场之间加一个静电场（起到能量聚焦的作用），静电场与磁场之间加有一个狭缝，固定了轨道曲率半径，使进入磁场离子的动能一致，提高了分辨率。

双聚焦质量分析器 双聚焦质量分析器是将一个静电场和一个磁场结合在一起的质量分析器。 双聚焦质量分析器同时实现了方向聚焦和能量聚焦，具有较高的分辨率； 双聚焦质量分析器分辨率高达几万，测定离子m/z精度为amu小数点后4~6位，可测定分子式，属于高分辨质谱。

四极杆质量分析器 （quadrupole mass analyzer） 应用: 多为台式质谱仪，应用于GC/MS 和 LC/MS 系统; 串联三级四极杆质谱仪，MS/MS; 磁分析器与四极杆分析器组成混合型串联质谱仪。

由四根相互平行的电极（金属杆）组成，对角电极相连，在两组电极上施加直流电压u和射频交流电压v。当具有一定能量的离子进入筒形电极所包围的空间后，受到交、直流叠加电场的作用，产生振荡和波动前进，在一定的电场强度和场半径条件下，对于某一种射频频率，只允许一种m/z的离子通过电场区到达检测器，这些离子称为共振离子，其它离子运动过程中撞击到圆筒电极上而被“过滤”掉。经改变电场强度（或频率），将不同质量离子送到检测器。

镀金的金属陶瓷四级杆 缺点 分辩率不高 优点 重现性好，可获得经典的质谱图; 由于用四极杆代替了笨重的电磁铁作为质量分析器，使质谱计结构简单，造价低，体积小，易操作，使用广泛。 与磁偏转质量分析器比较，扫描速度快，适合与GC-MS， LC-MS色谱联用 。

四极杆质量分析示意图

又称为三维四级质量分析器。原理和四极质量分析器类似。由于样品离子能在一定频率的三维射频场内短暂停留，故称离子阱。 离子阱质量分析器 又称为三维四级质量分析器。原理和四极质量分析器类似。由于样品离子能在一定频率的三维射频场内短暂停留，故称离子阱。 包括中间的环形电极和上下两个端盖电极。电极之间以绝缘隔开，其中两个端盖极是等电位的，端盖极上有小孔，以进入和排出样品离子。 离子阱既能直接用于不同质荷比离子的检测，又能用于时间上的串联质谱，后者就要求在离子阱内储存某种质荷比的离子。

优点： ① 单一的离子阱可实现多级串联质谱(MS)n，四极质量分析器的串联质谱是“空间上”的串联，由三个四极质量分析器串联而成，价格成倍增加。离子阱是“时间上”的串联质谱，因而价格是最低的； ② 灵敏度高，较四极质量分析器高10～1000倍； ③ 质量范围大，有的商品仪器已达6000u。离子阱的主要缺点是所得的质谱与标准图有一定差别，这是由于在离子阱中生成的离子有较长的停留时间，可能发生离子-分子反应之故。

3.2 仪器的基本功能 ⑴ 离子极化方式 通过改变加在离子源和离子通道上的电压极性，可以选择只让正离子或负离子进入质量分析器。一种物质在正离子和负离子方式下的质谱图完全不同，但可以相互补充。 ESI中的正离子和负离子方式

3.2 仪器的基本功能 ESI中的正离子和负离子方式 3.2 仪器的基本功能 ⑴ 离子极化方式 ESI中的正离子和负离子方式 离子在溶液中预先形成，酸性分子在溶液中形成负离子，而碱性分子则生成正离子。作为一般规则，由溶液中预先形成的离子极性决定离子极化方式的选择：如果分析物为酸性，则检测负离子；如果分析物为碱性，则检测正离子。在正离子检测方式下，获得的通常是质子加合离子，但加合其他离子的现象也较常见，如[M+Na]+、[M+Na+CH3OH]+、 [M+H+CH3OH]+、[M+NH4]+等，有时甚至很难观察到[M+H]+离子，得到加合其他离子的图谱。还可见聚合离子情况，如二聚体[2M+H]+、[2M+Na]+、三聚体[3M+H]+等。通过交替扫描可同时得到正离子和负离子质谱。

APCI中的正离子和负离子方式 一般在正离子方式下产生更强的离子流，特别对于含有碱性氮原子的分析物更是如此。 一个例外是酸性化合物如羧酸及酸性醇，它们产生的负离子比正离子更多。 尽管事实上负离子比正离子产生的少，但负离子方式有时是非常有意义的选择，这是由于负离子扫描方式产生的噪声比正离子方式低，具有更好的专属性。 APCI也可通过交替扫描同时获得正离子和负离子质谱。由于电晕放电针的高电压，使针上的电位从一极向另一极切换时的延迟时间在1s以上。

⑵ 碰撞诱导裂解 采用各种软电离技术易于得到十分有用的相对分子质量信息。 软电离技术生成的碎片离子很少；若先测得准分子离子，随后将其“打碎”，然后再测定碎片，这当然是最理想的情况。 为了使样品离子裂解生成碎片离子，采用惰性气体碰撞的方式来达到增加其内能目的。 通过碰撞使样品离子内能增加，进而裂解形成碎片离子叫做碰撞诱导裂解（collision-induced dissociation, CID）。 CID装置称为碰撞室。将碰撞前、后的离子分别称为前体离子和产物离子，较少用母、子离子的术语。

⑶ 扫描类型 全扫描 （full scan） 选择离子监测 （selected ion monitoring, SIM） 选择反应监测 （selected reaction monitoring, SRM）。

全扫描 提供样品中每一个分析物的全部质谱。用于测定或确认未知化合物的身份，或鉴定未知混合物中的每一个组分。为鉴定未知化合物，通常需要其全扫描质谱。 选择离子监测（SIM） 又称萃取离子监测，是对一个或一组特定离子进行检测的技术。当目标化合物的质谱已知时，可用SIM检测复杂混合物中少量的该化合物。SIM被用于痕量分析，以及快速筛选目标化合物。 选择反应监测（SRM） 利用串联质谱监测一个或多个特定的反应，如一个离子的碎裂或一个中性结构的丢失。在SRM中，首先选定前体离子，然后前体离子进行碰撞诱导裂解，生成产物离子，最后对选定产物离子进行扫描。

3.3 LC-MS 联用技术的优点 (1) 适用范围广。可以直接用于检测强极性化合物 (1) 适用范围广。可以直接用于检测强极性化合物 分子质量范围一般为m/z 50～2000，有的达到m/z 50～6000。 (2) 检测灵敏度高。专属性和通用性好，有较高的检测灵敏度， 能对复杂基质中痕迹量的组分进行定性和定量分析。 (3) 提供结构信息。可分别得到各组分的结构信息以及相对分子质量信息；利用碰撞诱导裂解能够进行多级质谱分析。 (4) 高样品通量。无需将样品完全色谱分离，所以在短时间内实现常规分析中的高样品通量。

在药物、化工、临床医学、分子生物学等许多领域中获得 3.4 应用与示例 在药物、化工、临床医学、分子生物学等许多领域中获得 了广泛的应用。对有机合成中间体、药物代谢产物、生物样 品、中药成分分析以及基因工程产品的大量分析结果为生产 和科研提供有价值的信息。 药物代谢产物鉴定 在复杂的基质中分离并定性鉴别药物及其各种代谢产物； 准确而精密地定量测定生物样品中药物及其代谢物的浓度。 中药成分分析 同时获得定量与定性信息 对于分离不佳的组分, 可以用选择离子检测(萃取离子检测) 获得指定质荷比一级与二级质谱信息, 有利于定性分析。

银杏叶提取物的LC-MS分析 图 银杏叶提取物的HPLC与TIC (正离子检测模式） a 银杏叶提取物液相紫外色谱图（350nm） b 银杏叶提取物质谱 总离子流色谱c 银杏叶提取物质谱总离子流色谱图（负离子检测模式）

R=OH 槲皮素(bilobalide)的衍生物 R1=OH,R2=R3=H ginkgolideA R=H 山奈素的衍生物 R1=R2=OH,R3=H ginkgolide

electrophoresis-mass spectrometry, CE-MS 4. 毛细管电泳-质谱联用技术 electrophoresis-mass spectrometry, CE-MS 仪器称为毛细管电泳-质谱联用仪 electrophoresis-mass spectrometer 20世纪90年代末期才发展起来的最新联用技术，是利用毛细管电泳的高分辨与质谱的高灵敏相结合的仪器，是强-强联合的仪器。 与LC-MS比较，主要差别是CE的背景电解质的流量（L/min）远小于HPLC流动相的流量（mL/min）。 CE-MS的接口与LC-MS有较大差别。一般情况下，能用于LC-MS的质谱仪，只要改变接口，也能用于CE-MS。

4.1 毛细管电色谱-质谱联用仪简介 ⑴ CE-MS联用仪方框图 CE ESI或APCI接口 DVD MS HPLC谱 组分的UV光谱 4.1 毛细管电色谱-质谱联用仪简介 ⑴ CE-MS联用仪方框图 CE ESI或APCI接口 DVD MS HPLC谱 组分的UV光谱 组分的n级质谱 TIC(总离子流色谱)

(2) 毛细管电泳-质谱联用仪的接口 离子源（接口）多采用电喷雾离子源（ESI源）。由于CE的背景电解质的流量为微升级，远远小于HPLC的毫升级，在通过ESI的喷嘴时较难形成雾滴。因此电喷雾离子源改为三套管式ESI源，即在流出液与喷雾气体间，增加了夹套液套管, 其主要作用是使由电泳尾端的流出液在ESI喷口处易形成雾滴。 毛细管电泳尾端的流出液在ESI的喷口处形成雾滴后，溶剂蒸发，雾滴体积缩小。待雾滴缩小至一定程度，由于雾滴中相同电荷离子相互排斥力加大，而产生“库伦爆炸”，形成不带溶剂的被检测离子，而后进入质谱的质量分析器。

4.2 毛细管电泳-质谱联用法的应用 主要应用于生物大分子、蛋白质和肽的分析，中药分析的报道相对较少，且多为生物碱类化合物。 4.2 毛细管电泳-质谱联用法的应用 主要应用于生物大分子、蛋白质和肽的分析，中药分析的报道相对较少，且多为生物碱类化合物。 由于使用了MS-MS联用技术，可以追踪碎片离子中的母离子，从而对化合物进行更加确切的指认， 在定量的同时对每种成分的结构进行了解析。 局限性 只能用含有挥发性缓冲盐的背景电解质，因而严重影响了CE的分离效果。近期兴起的毛细管电色谱-质谱（CEC-MS）可以不用含有非挥发性缓冲盐的流动相，仍然具有高选择性及高分离能力，有望解决上述难题。

5. 小结 掌握色谱联用技术的分类和目的；掌握GC-MS接口的作用和原理；掌握GC-MS的工作原理；掌握LC-MS对液相流动相的要求及离子化方式。 熟悉GC-MS、LC-MS和CE-MS的仪器组成、技术优点和基本应用方法。 了解CE-MS的工作原理和局限性。