環境奈米技術 授課教師：張章堂 中華民國九十九年三月

Principles and Procedures to Assess Nanomaterial Toxicity Outlines Introduction Paradigms for Assessing NM Toxicity Oxidative stress for ultrafine partilce Oxidative stress of cellular response Need for standard materials Overall Consideration in the Assessment Physico-chemical of NM Cell free assays Predictive in Vitro Toxicological Assays Use of Cellular Assays In vivo testing Nanosnsors Nanoelectrodes Online data bank

In vitro是拉丁語中「在玻璃裡」的意思，意指進行或發生於試管內的實驗與實驗技術。更廣義的意思，則指活生物體之外的環境中的操作。常見的例子是人工受精。在細胞生物學等領域中，由於此類實驗的環境與生物體內可能有所不同，因此可能與實際發生於生物體內的結果也不同。與此相反的用語是in vivo

Introduction NM Physico-chemical properties Small size Large surface area Durability … Interact with and cause damage to biological components Travel through the body, deposit in target organs ... Standard test methods to assess NM Toxicity ROS prodcution Generation of oxidative stress

Virus choice Properties of T7 Morphology Properties of MS2 Virions tailed; head. Short tail with 6 short fibers. Nucleocapsids isometric; 60 nm in diameter. Nucleic Acid Virions contain one molecule of linear double stranded DNA. Properties of MS2 Virions quasi-isometric elongated; not enveloped. Nucleocapsids 24-26 nm in diameter. Genome. Linear; single stranded; RNA. Surrogate for the human virus(Rubella、Influenza、Measles、Mumps)

Which kinds of Virus ?

Oxidative stress Definition Cellar glutathione (GSH) depleted. Oxidized glutathione (GSSG) accumulates. Durability … Small amount of ROS could be buffered. Excess amount of ROS lead to a drop of GSH/GSSG NM materials TiO2 CNT fullerene Carbon black

Glutathione(谷胱甘鈦 ) Glutathione為一種抗氧化物質，存在於身體的細胞中,藉由自身氧化以中和OH等自由基對脂肪酸或遺傳物質的傷害，並且可以藉葡萄糖產生的NADPH(由戊糖磷酸途徑)重新還原。 此物質不但在美白方面有舉足輕重的角色，在紅血球的抗氧化也占有一席之地，例如蠶豆症的病理解釋就跟此物質有關(因為蠶豆症的NADPH生成途徑受阻，造成Glutathione無法中和過多的氧化劑及自由基導致溶血) 。 Glutathione是由Glutamic acid, Cysteine, Glycerin三種氨基酸合成，所以若要增加Glutathione的量，除了直接攝取，還可以多攝取此三種氨基酸。

Overall considerations Process Cellar glutathione (GSH) depleted. Oxidized glutathione (GSSG) accumulates. Durability … Small amount of ROS could be buffered. Excess amount of ROS lead to a drop of GSH/GSSG NM materials TiO2 CNT fullerene Carbon black

Gene Gun

基因槍之優缺點 優點： 基因傳輸效率高 操作簡單 直接將基因打入細胞，利用細胞質傳遞至細胞核，對人體危害性最低無，副作用 缺點： 細胞膜被破壞 細胞表面濕度影響射入速度 成功率取決經驗

Application of Gene Gun Morphology: epithelial-like   Caco-2 cell monolayer (plane view) (b) BHK-21 Morphology: fibroblastoid adherent monolayer Caco-2 cell monolayer (section) B16-F10 Morphology:epithelial

(1)奈米微粒毒性探討目的 (2)材料與方法 (3)效應指標 (4)Nose-only exposure chamber

(1)奈米微粒毒性探討目的 以細胞實驗探討不同粒徑、不同數目濃度之超細微粒造成的毒理效應。 利用疾病動物模式探討不同粒徑、不同數目濃度之超細微粒造成的毒理效應。 發展適合超細微粒健康風險評估之疾病動物模式及暴露系統。

(2)材料與方法 A.聚苯乙烯微粒 Polystyrene microspheres, Polysciences, Park Scientific, Northamton, U.K.) 64nm, 109, 202nm 1 mg contain 6.95 x 1012, 4.55 x 1011, 2.21 x 1011 particles, respectively.

B. 細胞實驗 A549細胞，人類第二型肺泡上皮細胞 株(CCRC 60074, 新竹食品工業發展研究所) BEAS-2B細胞，正常人類支氣管上皮細胞株 (CRL-9609, ATCC)

Cytokine IL-8 及 IL-6測定 (ELISA) 移至transwell 奈米微粒64、109、202nm, 100 μ g/mL暴露四小時 奈米微粒64、109、202nm, 1 mg/ml 暴露四小時 Cytokine IL-8 及 IL-6測定 (ELISA)

D. 病變測試 微粒暴露後，A549細胞IL-8增加。 低濃度之劑量反應較高濃度明顯。 A549細胞IL-6無顯著增加。

E.動物實驗 3月大雄性Sprague-Dawley (SD)大鼠，以Monocrotaline (60mg/kg)誘發肺高血壓。 以氣管灌注(intratracheal instillation)給予奈米微粒 對照組(n=4)，saline，0.5ml 低濃度組(n=4) ，50nm polystyrene, 100ug/ml，0.5ml 高濃度組(n=1)，50nm polystyrene, 1 mg/ml，0.5ml 暴露後24小時將大鼠犧牲，收集肺灌洗液、組織及周邊血液。

(3)效應指標 呼吸道發炎指標 (Markers of inflammation and lung injury) 肺泡灌洗液 (Bronchoaleolar lavage fluid) 總細胞數 (Total cell count) 白血球分類 (WBC differential) 乳酸脫氫酵素 (Lactate dehydrogenase activity) 總蛋白質 (Total protein) 氧化壓力指標 (Markers of oxidative stress) Glutathione in lung tissue 8-OHdG in peripheral blood Markers of proinflammtory mediators Cytokine IL-6 Cytokine IL-8 TNF-α

A.呼吸道發炎指標 灌洗液中總細胞數及嗜中性白血球顯著增加，顯示暴露50nm奈米微粒後肺部有顯著的發炎反應。

B.氧化壓力指標 Glutathione在暴露微粒組降低，代表微粒反應後會增加肺部細胞氧化代謝反應。

(4)Nose-only exposure chamber

超細微粒產生 稀釋空氣 CPC測量數目濃度 鼻部暴露腔

A.生理循環監測系統 信號接收器 (Receiver) 植入器 ( transmitter)

B. 呼吸生理監測系統