生物技术大实验 生物油脂发酵过程工艺控制 2010年11月29日

生物油脂发酵过程工艺控制 一、实验目的 学会菌种在小型发酵罐中培养的过程； 包括培养基和设备的灭菌， 种子的培养、接种、发酵工艺控制等， 巩固所学的有关发酵过程的控制、中间补料、溶氧控制、变温发酵等工艺， 学会分析代谢曲线， 掌握有关参数糖、氮及油脂的定量分析方法。

●微生物细胞仅含有2%～3%的油脂，在特定的条件下培养，油脂占细胞干重30% ～40%，甚至达到70%以上的油脂 ； 二、实验原理 1、生物油脂(Lincomycin) ●微生物油脂，又称为单细胞油脂（single cell oil, SCO），是某些微生物在特定条件下产生的，在细胞内过量贮存的脂肪酸甘油酯 ； ●产油微生物通常可分为三大类：酵母和霉菌、藻类、细菌 ； ●微生物细胞仅含有2%～3%的油脂，在特定的条件下培养，油脂占细胞干重30% ～40%，甚至达到70%以上的油脂 ；

●微生物油脂的脂肪酸组成与植物油脂相似，主要是C16、C18系脂肪酸，如棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、油酸及少量多不饱和脂肪酸等 ： ●微生物油脂用途广泛，通过与醇反应，可生产生物柴油、润滑油、溶剂油等产品，同时还可作为获取高附加值脂肪酸，如y-亚麻酸(GLA) 、花生四烯酸(ARA) 、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)等的原料 ； ●生物柴油是典型的“绿色能源”，大力发展生物柴油对推动社会经济可持续发展，减轻环境压力具有重要的战略意义。 因此，生物油脂研究具有广阔发展空间。

2、生物油脂的发酵生产 ●利用斯达氏酵母菌Lipomyces starkeyi进行流加分批发酵生产油脂。 ●菌种 主细胞库（﹣18℃下孢子保存） →经过6天的培养→工作细胞库（0~4℃保持15天）→投入生产； ●发酵生产 采用二级发酵，整个过程耗时5~10天左右，→ 分离提取；

●油脂酵母菌种菌体的显微结构 斯达氏酵母（Lipomyces starkeyi）苏丹黑B脂肪粒染色(>200倍)

本试验采用斯达氏酵母菌Lipomyces starkeyi进行深层液体发酵生产油脂，发酵方式为流加分批发酵。 生物油脂的发酵过程一般可分为两阶段：0～50h, 菌丝生长期；50～120h，此段时间内生长期转向油脂生产（积累）期，此后阶段主要是油脂生产（积累）期。

三、材料与试剂 1、菌种 斯达氏酵母（Lipomyces starkeyi） 2、仪器 BIOTECH-7BG型发酵罐、紫外分光光度计、显微 镜、台式离心机、旋转蒸发仪等。

3、培养基(g/L) A、葡萄糖 50、磷酸二氢钾 2.5、磷酸氢二钠 0.5、硫酸铵 1、尿素 1、MgSO4·7H2O 1、酵母膏 0.5、FeSO4 0.1、琼脂20、调pH5.8~6。（优选） B、YEPD培养基(g/L) :葡萄糖20、酵母浸出汁10、蛋白胨10；固体培养基在YEPD基础上加入2%琼脂粉，pH自然。

（2）液体种子培养基(g/L) 葡萄糖 20、酵母膏（浸出汁）10、蛋白胨 10、pH自然。 （3）基础限氮发酵培养基(g/L) （发酵罐、摇瓶）： 葡萄糖 15，木薯淀粉 55（木薯淀粉用淀粉酶水解），NH4(SO4)2 2.5，KH2PO4 1.5，酵母粉为 0.9 ，MgSO4.7H2O 0.9，pH 5.8~6.0。

(4)、补料培养基(g/L) 木薯淀粉300，用淀粉酶（1g，1 ∶ 300）水解。 (5)、发酵消泡剂配比（v∶v） 泡敌：豆油：水=2.5∶5.5∶30； 或用纯豆油。 (6) 培养基灭菌方法： 培养基等配好后在蒸汽灭菌罐内于121℃下灭菌30分钟；补料培养基在121℃灭菌30分钟。

四、实验方法 1、发酵工艺流程为： 菌种母斜面 → 菌种子斜面 → 摇瓶种子 →发酵 2、斜面种子培养： 从母种培养基取种接种于斜面培养基上，30℃恒温培养7d左右。 3、摇瓶种子培养： 500ml摇瓶加入50 ml 种子培养基（或30ml/250ml三角瓶），灭菌后冷却，将斜面挖一小块0.5cm2放入培养基中，摇床转速200 r/min，30℃培养24h。

4、发酵工艺条件及控制 （1）罐上发酵： ●以10%（v/v）接种量接种于7L（装液4.5L）发酵培养基中，30℃，pH6.0±0.2，0.03Mpa，4L/min（初始）,250 r/min（初始），补料分批培养，用10%NaOH自动调节pH，到120小时（5~6d）左右放罐。发酵周期5~7天。

●参数控制： T=30±1℃；pH=6.0±0.2（用10%NaOH调pH，手调）；P（灌压）=0.03MP； 溶氧DO控制： （A）0711班控制溶氧（DO）在65%（±5%）水平。 （B）0712班控制溶氧（DO）在20%（±5%）水平。 接种后培养8hr（视具体情况而定，也有可能在16h以后）后，通过调节空气流量和转速，分别控制溶氧（DO）在60%（±5%）、15%（±5%）两个不同的水平。

● 控制总糖在2.0~3.0 g/L，还原糖在1.0 g/L，若总糖含量较高，可不控制糖浓度。 补料速率：根据还原糖分析结果进行分批补料。

●放罐条件： 放罐前24h或12h停止补料。 还原糖：0.2%~0.5%(2~5g/L)。 ●参数测定及记录 在线参数每1hr记录一次；离线参数每4hr取样分析一次，包括总糖、还原糖、氨基氮、菌体浓度、pH、油脂含量等。

5、离线参数测定： 每4小时取一次样，分析以下项目： ●美蓝染色，镜检观察，并记录菌体形态。 ●菌体浓度测定：取10ml发酵液，3000r/ min离心15min，计算沉降物重量百分比(%)=沉降物重量/发酵液总重量。（见附录1） ●取发酵液离心后的上清液用DNS(3’，5’—二硝基水杨酸)比色法测还原糖，总糖的测定用苯酚一硫酸法测定。 （见附录2） ●取发酵液离心后的上清液用甲醛滴定法测氨基氮（见附录3） ●油脂的提取及定量测定：用酸热法提取油脂（在100℃水浴锅加热，注意不要用电炉加热 ），用石油醚-乙醚法测定油脂含量。 （见附录4）

6、在线参数测定 在发酵罐上连续测定pH、溶氧(DO)、转速、流量、温度等。 7、记录所测参数，记入生物油脂发酵批报表 。 8、在实验报告中需将原始数据列入，并做代谢曲线图。 9、三项工作：a、罐发酵；b斜面接种；c实验报告。

五、有关分析方法 1、菌体浓度的测定 秤重法：X=(W2－W0)/(W1－W0)×100% 单位：%（wt/wt，湿重），即10g/L。 2、还原糖的测定 DNS(3’，5’—二硝基水杨酸)比色法测还原糖法测定还原糖， 还原糖 ＝[(A -B) ×C/ W ]×样品稀释倍数 单位： g/L

3、氨基氮的测定 甲醛法测定， 单位：mg/mL 4、生物油脂的含量测定 ： 石油醚-乙醚法 ： g/L ；

早7:00-14:30；中14:30-22:00；晚22:00-7:00。 六、注意事项 1、实验仔细认真，每组及各组间要密切配合； 2、排班时间： 早7:00-14:30；中14:30-22:00；晚22:00-7:00。 每组接班要提前15min到，并做好交接班工作； 3、特别注意安全问题：水电气。 4、实验报告按论文的格式写，包括原始数据和图表等，重在分析讨论(不得抄袭他人)。 5、门卫曾师傅电话：68418999，13912775450。

谢 谢！ 祝大家实验顺利！