逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR） Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction

实验目的 实验原理 实验过程 注意事项

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1、了解RT-PCR的原理、反转录酶的特性 2、掌握RT-PCR的基本操作过程 RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统等。

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rRNA(80-85%)；tRNA(15-20%)； mRNA(1-5%)

随机引物法是三种方法中特异性最低的。引物在整个转录本的多个位点退火，产生短的，部分长度的cDNA。这种方法经常用于获取5'末端序列及从带有二级结构区域或带有逆转录酶不能复制的终止位点的RNA模板获得cDNA。为了获得最长的cDNA，需要按经验确定每个RNA样品中引物与RNA的比例。随机引物的起始浓度范围为50到250ng每20μl反应体系。因为使用随机引物从总RNA合成的cDNA主要是核糖体RNA，所以模板一般选用poly(A)+RNA。 Oligo(dT)起始比随机引物特异性高。它同大多数真核细胞mRNA 3'端所发现的poly(A)尾杂交。因为poly(A)+RNA大概占总RNA的1%到2％，所以与使用随机引物相比，cDNA的数量和复杂度要少得多。因为其较高的特异性，oligo(dT)一般不需要对RNA和引物的比例及poly(A)+选择进行优化。建议每20μl反应体系使用0.5μg oligo(dT)。oligo(dT)12-18适用于多数RT-PCR。 基因特异性引物（GSP）对于逆转录步骤是特异性最好的引物。GSP是反义寡聚核苷，可以特异性地同RNA目的序列杂交，而不象随机引物或oligo(dT)那样同所有RNA退火。用于设计PCR引物的规则同样适用于逆转录反应GSP的设计。GSP可以同与mRNA 3'最末端退火的扩增引物序列相同，或GSP可以设计为与反向扩增引物的下游退火。

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反转录体系 第一步： 0.5 ml离心管中 模板RNA 2uL dNTP 2uL oligodT 2uL DEPC水补充到14uL 70℃ 5min 4 ℃ 10min；短暂离心； 第二步： 5×buffer 4uL 0.1 mol/L的DTT 1uL Rnase Inhibitor 混匀，离心，42 ℃孵育2-5分钟； 逆转录酶M-MLV 1uL 42 ℃中，水浴60 min； 95 ℃ 5min 终止反应； -20 ℃保存备用。

PCR (Polymerase Chain Reaction) 聚合酶链反应 PCR (Polymerase Chain Reaction) It simulates the replication of DNA and makes it happen continuously

历 史 1983.4 Kary Mullis在开车前去北加利福尼亚红树县Redwood country的一条被月光笼罩的山路上构思了PCR 历 史 1983.4 Kary Mullis在开车前去北加利福尼亚红树县Redwood country的一条被月光笼罩的山路上构思了PCR 随后卖给了Roche公司 价格：10,000$ 1993 Nobel prize

PCR? PCR只是一个简单的不起眼玩艺 ——凯利·穆利斯（Kary Mullis) 它最大的特点就是能不断推出新形式。 —— 摘自[Making PCR: A Story of Biotechnology by Paul Rabinow]

什么是PCR? 我不认为PCR能够用两种“革命”(政治革命和科学革命)加以说明。……它的发明并没有改变基因操作的本质。有了PCR，我们能在更广的范围内更快、更容易地进行基因操作，学术界也完全不用等到某人死去或退休后才能接受PCR。它只不过是一种新工具。 ——凯利·穆利斯（Kary Mullis)

PCR及有关技术的发展历史 九十年代中期PCR临床应用在国内全面展开 ，Cetus 公司的 K. Mullis在这年底（12月16日第一次成功实验）发明了PCR。 九十年代中期PCR临床应用在国内全面展开 1998年 实时荧光PCR技术开始在中国较广泛的应用于临床检测 1999年 西方发达国家尝试将PCR应用于血液筛查

PCR发明过程的简单回顾

PCR的基本原理 PCR三步曲 PCR过程 变性、复性、半保留复制 变性 90～97℃ 退火 45～55℃ 延伸 72℃左右 变性 90～97℃ 退火 45～55℃ 延伸 72℃左右 PCR过程 一生二，二生四，四生万物

PCR 循环 – 第一步 – 加热变性 靶序列 靶序列

PCR 循环- 第二步 – 引物与靶序列退火 靶序列 3’ 5’ 5’ 3’ Biotin Primer 1 Primer 2 Biotin

PCR 循环 - 第三步 - 引物延伸 靶序列 3’ 5’ 5’ 3’ Biotin Primer 1 Primer 2 Biotin 3’ Taq DNA Polymerase Primer 2 Biotin 3’ 5’ 5’ 3’ 靶序列

第1个 PCR 循环完成后 – 得到两个拷贝的靶序列 Biotin Biotin 靶序列

30次循环后靶序列扩增的数量 7 cycle = 128 Amplicon No. of No. Amplicon Cycles Copies of Target 1 2 2 4 3 8 4 16 5 32 6 64 20 1,048,576 30 1,073,741,824 1 cycle = 2 Amplicon 2 cycle = 4 Amplicon 3 cycle = 8 Amplicon 4 cycle = 16 Amplicon 5 cycle = 32 Amplicon 6 cycle = 64 Amplicon 7 cycle = 128 Amplicon

Compare PCR with DNA Replication DNA Replication PCR 解链方式 Topoisomerase Heating 引 物 RNA primer DNA primer 延 伸 DNA polymerase I Taq DNA polymerase 反应数 细胞分裂一次 Continuously DNA复制一次 25-30cycles

PCR反应体系的五要素： 引物 酶 dNTP 模板 Mg2+

引物决定了PCR产物的特异性 引物的设计应遵循一定的原则 一对引物，对应于欲扩增序列的上游及下游 Sense and Antisense 长度：15～30个核苷酸 引物内、引物间不应有互补序列 尽量保障引物与非特异扩增区无同源性

引物的Tm值：引物－模板双链体的解链温度。 Tm＝4（G+C）+2(A+T) 决定于引物的长度及碱基的组成。 退火温度和Tm值是影响模板与引物结合的关键 引物的3’端： 应当尽量没有错配 避免为T，以免发生错配； 避免用A，防止结合自由能太低，影响延伸效率； 避免用GC多组合。

Taq DNA聚合酶 来自水生栖热菌 Thermusaquaticus 良好的耐热性 Mg2+依赖性 Taq DNA聚合酶的一个致命的弱点是它的出错率，一般PCR中出错率为2*10^－4核苷酸/每轮循环

在100μl PCR反应中,1.5-2单位的Taq DNA聚合酶就足以进行30轮循环.

4种三磷酸脱氧核苷酸(dNTP) 一般反应中每种dNTP的终浓度为20-200μmol/L。理论上4 种 dNTP各20μmol/L,足以在100μl反应中合成2.6μg的DNA。 当dNTP终浓度大于50mmol/L时可抑制Taq DNA聚合酶的活性.4种dNTP的浓度应该相等,以减少合成中由于某种dNTP的不足出现的错误掺入。

模板 PCR反应必须以DNA为模板进行扩增, 模板DNA可以是单链分子,也可以是双链分子,可以是线状分子,也可以是环状分子(线状分子比环状分子的扩增效果稍好). 就模板DNA而言,影响PCR的主要因素是模板的数量和纯度.一般反应中的模板数量为10^2 -10^5 个拷贝,对于单拷贝基因,这需要0.1μg的人基因组.扩增多拷贝序列时,用量更少.灵敏的PCR可从一个细胞,一根头发,一个孢子或一个精子提取的DNA中分析目的序列.模板量过多则可能增加非特异性产物.DNA中的杂质也会影响PCR的效率。

Mg2+ Mg2+浓度对Taq DNA聚合酶影响很大,它可影响①酶的活性和真实性,影响②引物退火和解链温度, 影响③产物的特异性以及引物二聚体的形成等。 通常Mg2+ 浓度范围为0.5-2mmol/L.对于一种新的PCR反应,可以用0.1-5mmol/L的递增浓度的Mg2+ 进行预备实验,选出最适的Mg2+浓度。

PCR反应的过程： There are 3 main steps in the replication of DNA 1、DNA双链解离为单链。（double strands single strands） 2、引物的合成。(primer synthesize) 3、DNA链的延伸。(extention)

Also 3 steps in PCR 1, Denaturation(变性)：通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，DNA双链解离形成单链。 Heating +

2，Annealling（退火）：当温度突然降低时，引物与其互补的 模板按碱基配对的原则在局部形成杂交链。 3, Extention（延伸）：在DNA聚合酶的作用下，以引物为起 点， DNA链按5’ 3’的方向延伸。 +

PCR反应的程序设计： 程序设置： 94℃ Xs 55℃ Xs 72℃ Xs X个循环 （一般在72℃时酶催化核苷酸的标准速率可达35～100个核苷酸/秒） 72℃ 5m 一般在扩增反应完成后,都需要一步较长时间(10-90min)的延伸反应,以获得尽可能完整的产物, 这对以后进行克隆或测序反应尤为重要。

PCR中的注意事项 PCR反应中可能出现的问题： 假阴性，不出现扩增条带 假阳性 出现非特异扩增带

PCR中的注意事项 （一）防止污染 （二）设立对照： 试剂小量分装 吸头及EP管一次性使用 器皿及工作区域要分开，无菌操作 阳性对照： 阳性模板 阴性对照： 阴性模板 试剂对照： 除模板外的所有组分

PCR的反应特点 特异性强 灵敏度高：PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将pg=10- 12级的起始待测模板扩增到微克(g= 10 -6)水平 简便、快速：PCR反应一般在2～4 小时完成扩增反应 对标本的纯度要求低： DNA 粗制品可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体液、毛发、细胞、活组织等扩增检测

管家基因(house-keeping genes)，是所有细胞中均要表达的一类基因，其产物是对维持细胞基本生命活动所必需的。如微管蛋白基因、糖酵解酶系基因与核糖体蛋白基因等。是指在生物体内所有细胞中都表达，并且为维持细胞基本生命活动所需而时刻都在表达的高度保守的基因。

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1. 逆转录反应过程，需建立无RNAase环境，以避免RNA的降解。 2 1.逆转录反应过程，需建立无RNAase环境，以避免RNA的降解。 2.成功的逆转录反应决定于高质量的模板RNA。高质量的RNA至少应保证全长并且不含逆转录酶的抑制剂，如EDTA或SDS。此外，RT-PCR所遇到的一个潜在的困难是RNA中沾染的基因组DNA。使用较好的RNA分离方法，如Trizol Reagent，会减少RNA制备物中沾染的基因组DNA。因此在进行PCR反应时应该对每个RNA模板进行一个无逆转录的对照反应，以确定扩增出来的片段是来自基因组DNA还是cDNA。在无逆转录时所得到的PCR产物来源于基因组。 3.RT-PCR的起始模板可是总RNA或mRNA，都可以检测到扩增结果。 4.在逆转录反应中经常加入RNA酶抑制蛋白以增加cDNA合成的长度和产量。RNA酶抑制蛋白要在第一链合成反应中，在缓冲液和还原剂(如DTT)存在的条件下加入，因为cDNA合成前的过程会使抑制剂变性，从而释放结合的可以降解RNA的RNase。RNA酶抑制蛋白仅防止RNase A，B，C对RNA的降解，并不能防止皮肤上的RNase，因此尽管使用了这些抑制剂，也要小心试验者的手上Rnase对样品的污染。 5.较高的保温温度有助于RNA二级结构的打开，增加了反应的产量。对于多数RNA模板，在没有缓冲液或盐的条件下，将RNA和引物在65-70 ℃保温，然后迅速置于冰上冷却，可以消除大多数二级结构，从而使引物可以结合。然而某些模板仍然会存在二级结构，即使热变性后也是如此。对这些困难模板的扩增可以使用经过改良的耐高温逆转录酶，使逆转录反应置于较高温度下进行以改善扩增。而且适当提高逆转录保温温度，可增加RT-PCR的特异性。 6.建立反应体系时，加完其它反应物后，才加模板DNA和Taq DNA聚合酶；然后将全部反应物涡旋混匀；上PCR仪前加矿物油封盖或设热盖。 7.PCR反应的循环数一般25-30次就足够了，过多的循环数会造成非特异性扩增和时间的浪费。复性温度的计算，一般是在引物的Tm值上下浮动，Tm =2(A+T)+4(G+C)。适当提高复性温度可提高PCR扩增的特异性。