第二章 微生物药物

一、微生物药物的几个相关基本概念 二、微生物药物的分类 三、微生物药物的应用 四、药源微生物及微生物药物的筛选技术 五、微生物药物的发酵生产技术 六、微生物药物的分离、精制和鉴别 七、废弃物的综合利用和环境保护

四、药源微生物及微生物药物的筛选技术 （一）药物的产生菌 （二）新药产生菌的分离 （三）新微生物药物的筛选 （四）微生物药物产生菌的菌种改良 （五）微生物药物产生菌的保藏

（三）新微生物药物的筛选 1、初筛发酵 初筛发酵是能否产生抗生素的关键，需要选择适合的发酵培养基和培养条件，以利于抗生素的合成。

培养基主要是供给微生物生长和合成抗生素的材料。 培养基成分 碳源 糖类、脂肪、某些有机酸、醇或碳氢化合物 供给微生物生命活动所需要的能量以及构成菌体细胞成分和代谢产物。 氮源 蛋白胨、黄豆饼粉、花生饼粉、玉米浆、肉膏、酒泥 硫酸铵、氨水、硝酸盐等 供给微生物生长所需的氮素，构成菌体原生质 无机盐、微量元素 磷、镁、钾、钠等 铁、铜、锌、锰、钴、钼等 可以作为生理活性物质的组成或生理活性作用的调节物

初筛方式： 固体平板发酵—— 液体振荡培养—— 便于大量筛选抗菌物质时采用。 放线菌大都为好氧菌，增加溶解氧有利于放线菌生长和抗生素的合成。

2、筛选模型的研究与应用 Woodruff等的经典筛选 10000株新分离的放线菌 2500株对细菌有抗菌活性 250株链丝菌素类 交叉耐药试验和纸层鉴别 2500株对细菌有抗菌活性 250株链丝菌素类 125株链霉素类 40株四环素类 55株其他已知抗生素 500株 30株（可能是新抗生素） 10种新化合物 毒性试验 1种有希望的化合物，低毒性，体内有效 新抗生素/分离的菌株数：1/1000 新抗生素/已知抗生素：1/50 有希望的抗生素/分离的菌株数：1/10000

琼脂扩散法——利用多种微生物作为检定菌，筛选有抗菌活性的物质。 （1）常规的筛选方法 琼脂扩散法——利用多种微生物作为检定菌，筛选有抗菌活性的物质。 非致病菌 抗生素耐药突变株和超敏菌株 厌氧菌 协同活性检测

（2）定靶筛选 从临床有效的抗生素的作用机理和细菌的耐药机理来设计筛选模型，有目的地筛选具有某种作用机理的抗生素，试图获得抗菌作用强、对耐药菌有效、毒性小的新抗生素。 以作用机理为依据的筛选方法 以耐药机制为依据的筛选方法

细菌细胞壁合成抑制剂的筛选 土壤分离的微生物（10200株）（细菌、真菌和放线菌） 第一步： 抗微生物活性：细菌 支原体 + - （487） （238） （1530） nanaomycin A、B、C、D、E freonolicin B cervinomycins 第二步： 测定抑制同位素渗入 meso-[3H]二氨基庚二酸 L-[14C]亮氨酸 + - asukamycin Setomimycin vineomycins 其他 细胞壁合成抑制剂（141） 小分子量：azureomycin A和B（新） AM-1034 AM-5289 Amphomycin，青霉素G 大分子量：ristocetin A 和B 其他（11种） 用Diaflo UM-2膜测定相对分子质量（1000以下）

以耐药机制为依据的筛选方法 抗生素的广泛使用和一些不合理的滥用，引起细菌耐药性的增加，而细菌耐药机制的研究进展又使耐药性的解决成为可能。

细菌的耐药机制主要有4种： 细菌产生一种或多种水解酶或钝化酶来水解或修饰进入细菌细胞内的抗生素，使之失去生物活性； 抗生素的作用靶点由于发生突变或被细菌的某种酶修饰而使抗菌药物无法发挥作用，以及抗生素作用的靶酶的结构发生改变使之与抗生素的亲和力下降； 由于细菌细胞膜渗透性的改变或其他有关特性的改变； 细菌具有一种依赖于能量的主动转运机制，它能够把进入胞内的药物泵至胞外。

联合使用β-内酰胺酶以及敏感和耐药突变株 通过颜色变化来检测β-内酰胺酶抑制剂 诱导β-内酰胺酶方法的应用 β-内酰胺酶抑制剂的筛选 β-内酰胺酶是一类能够破坏具有β-内酰胺结构抗生素的钝化酶的总称。许多致病菌由于产生β-内酰胺酶而对青霉素和头孢菌素具有抗性。 β-内酰胺酶抑制剂的筛选主要依据抑制剂抑制β-内酰胺酶，使酶失去活性，不能水解β-内酰胺类抗生素，使抗生素保持生物活性，从而抑制细菌生长繁殖。 耐药菌株平板法 液体测定法 联合使用β-内酰胺酶以及敏感和耐药突变株 通过颜色变化来检测β-内酰胺酶抑制剂 诱导β-内酰胺酶方法的应用

3、高通量筛选 高通量筛选（high throughput screening）技术是20世纪80年代后期形成的寻找新药的高新技术。 将许多模型固定在各自不同的载体上，用机器人加样，培养后用计算机记录结果，并进行分析，可以实现大规模的筛选。

高通量筛选的模型： 细胞模型——观察待测样品对细胞的作用，反映药物对细胞生长等过程的综合作用。包括各种正常细胞和病理细胞。 分子模型——包括受体、酶等，药物作用的靶点明确。 其他模型

现阶段的微生物药物筛选主要研究方面： 产生菌的来源 微生物的初筛发酵 新的筛选模型和方法

四、药源微生物及微生物药物的筛选技术 （一）药物的产生菌 （二）新药产生菌的分离 （三）新微生物药物的筛选 （四）微生物药物产生菌的菌种改良 （五）微生物药物产生菌的保藏

（四）微生物药物产生菌的菌种改良 自然选育 诱变育种 杂交育种 基因工程技术改良菌种 目的——将产生菌的一些有益变异，通过不断的筛选和培育，为研究和生产提供更多合乎需要的高产优质新菌种。 自然选育 诱变育种 杂交育种 基因工程技术改良菌种

1、自然选育 在生产过程中，不经过人工诱变处理，根据菌种的自发突变而进行菌种筛选的过程，叫做自然选育或自然分离。 自然选育包括 从自然界分离获得菌株 根据菌种的自发突变进行筛选而获得菌种。

1）从自然界分离获得菌株 一般包括以下几个步骤：采样、增殖培养、纯种分离和性能测定等。 调查研究（包括资料查阅） ↓ 试验方案设计 采样 第一次增殖培养 第一次平板分离 第二次增殖培养 第二次平板分离 第二次原种斜面 初筛（1株1瓶） 增殖条件摸索→ 第一次原种斜面→ ←定性或半定量测定

第三次平板分离 ↓ 第三次原种斜面 复筛（1株3-5瓶） 第四次平板分离 第四次原种斜面 再复筛 较优化菌株1-3株 →第三次原种保藏 不纯 初步工艺条件摸索→ ←种子培养 保藏及进一步做生产性能试验或作为育种的出发菌株 某些必要试验和毒性试验等

2）从自发突变体中获得菌株 变异是育种的基础。 自然突变是指自然条件下出现的基因变化。 自发突变的频率较低，因此自然选育筛选出来的菌种，不能满足育种工作的需要。因而不能仅停留在“选”种，还要进行“育”种。如通过诱变剂处理菌株，就可以大大提高菌种的突变频率，扩大变异幅度，从中选出具有优良特性的变异菌株 ——诱变育种。

2、诱变选育 人工诱变能提高突变频率和扩大变异谱，具有速度快、方法简便等优点，是当前菌种选育的一种主要方法，使用普遍。 诱发突变随机性大，必须与大规模的筛选工作相配合才能受到良好的效果。

诱变育种的主要环节： 以合适的诱变剂处理大量而均匀分散的微生物细胞悬浮液（细胞或孢子）以引起绝大多数细胞致死的同时，使存活个体中DNA碱基变异频率大幅度提高； 用合适的方法淘汰负效应变异株，选出极少数性能优良的正变异株，以达到培育优良菌株的目的。

出发菌株的选择 菌悬液的制备 前培养 诱变 变异菌株的分离和筛选

1）诱变剂 物理诱变剂 化学诱变剂 生物诱变剂 乙基磺酸乙酯（EMS）、亚硝基胍、亚硝酸、氮芥等。 噬菌体、转座因子 各种射线，如紫外线、X射线、β射线、γ射线、α射线和超声波等 物理诱变剂 化学诱变剂 生物诱变剂 乙基磺酸乙酯（EMS）、亚硝基胍、亚硝酸、氮芥等。 噬菌体、转座因子

防护罩 防护衣 防护面罩

各种化学诱变剂常用的剂量和处理时间 诱变剂 诱变剂的剂量 处理时间 缓冲剂 中止反应方法 亚硝酸（HNO2） 0.01～0.1mol/L 5～10min pH值4.5，1mol/L醋酸缓冲液 pH8.6，0.07磷酸二氢钠 硫酸二乙酯（DES） 0.5～1％ 10～30min， 孢子18～24h pH值7.0，0.1mol/L磷酸缓冲液 硫代硫酸钠或大量稀释 甲基磺酸乙酯（EMS） 0.05～0.5mol/L 10～60min， 孢子3～6h 亚硝基胍（NTG） 0.1～1.0 mol/mL， 孢子3mg/mL 15～60min， 90～120min pH值7.0，0.1mol/L磷酸缓冲液或Tris缓冲液 大量稀释 亚硝基甲基胍（NMU） 0.1～1.0 mol/mL 15～90min pH值6.0～7.0，0.1mol/L磷酸缓冲剂或Tris缓冲液 氮芥 NaHCO3 甘氨酸或大量稀释 乙烯亚胺 1:1000～1:10000 30～60min 羟胺（NH2OH∙HCl） 0.1～0.5％ 数小时或生长过程中诱变 氯化锂（LiCl） 0.3～0.5％ 加入培养基中，在生长过程中诱变 秋水仙碱（C22H25NO6） 0.01～0.2％

2）影响诱变效果的因素 选择合适的出发菌株 采用分散状态的孢子悬浮液处理 采用单核细胞（或核质体）处理 注意微生物的生理状态 适宜的诱变剂量 出发菌株的遗传特性； 诱变剂； 菌种的生理状态； 被处理菌株的预培养和后培养条件； 诱变处理时的外界条件等。 选择合适的出发菌株 采用分散状态的孢子悬浮液处理 采用单核细胞（或核质体）处理 注意微生物的生理状态 适宜的诱变剂量

3）筛选的方法 制定筛选方案 出发菌种（砂土管或冷冻管） ↓ 斜面→或肉汤培养24 h 单孢子悬液 诱变处理 菌悬液 稀释涂布平板 方案设计的中心内容是确定诱变筛选流程。 出发菌种（砂土管或冷冻管） ↓ 斜面→或肉汤培养24 h 单孢子悬液 诱变处理 稀释涂布平板 挑取单菌落传种斜面 菌悬液 ——处理前后的孢子液或细菌悬液作活菌计数并统计其存活率 ——观察单菌落形态并统计其形态变异率

菌种保藏（砂土管、冻干管或制备固体孢子） 摇瓶初筛 ↓ 挑出高产斜面 菌种保藏（砂土管、冻干管或制备固体孢子） 摇瓶复筛（复筛次数及摇瓶数以及培养基种类根据情况决定） 挑出高产菌株 作稳定性试验和菌种特性考察 放大试验罐、中试考察 大型投产试验 传种斜面（或直接用固体孢子） ——对照组

突变株的筛选方法 淘汰野生型菌株的方法有： 抗生素法、菌丝过滤法、差别杀菌法和饥饿法等。 营养缺陷型菌株的检出方法有： 一般经诱变后，再经中间培养、淘汰野生型、检出营养缺陷型、确定生长谱等。 淘汰野生型菌株的方法有： 抗生素法、菌丝过滤法、差别杀菌法和饥饿法等。 营养缺陷型菌株的检出方法有： 逐个测定法、夹层平板法、限量营养法和影印接种法等。

影印平板（Replica plating）法是Lederberg夫妇在1952年建立

用梯度平板法定向培育若干代谢产物的高产菌株 产生菌 抗代谢物 肌苷 Bacillus pumilus（短小芽胞杆菌） 8-氮鸟嘌呤 Corynebacterium sp（一种棒状杆菌） 6-硫鸟嘌呤 腺嘌呤 Salmonella typhimarium（鼠伤寒沙门氏菌） 2，6-二氨基嘌呤 烟碱酸 Chlamydomonas eugametos（一种衣藻） 3-乙酰吡啶 色氨酸 Salmonella typhi（伤寒沙门氏菌） 6-甲基色氨酸 甲硫氨酸 Escherichia coli（大肠杆菌） 乙硫氨酸 酪氨酸 E.coli 对氟苯丙氨酸 吡咯叠氮（pyrrolnitrin） Pseudomonas aureofaciens（金色假单胞菌） 6-氟色氨酸 亮氨酸 S.typhi 三氟-DL-亮氨酸

摇瓶筛选法 琼脂块筛选法 随机筛选 筛选自动化和筛选工具微型化 理性化筛选 根据形态变异淘汰低产菌株，根据平皿反应挑取高产菌株。 运用遗传学、生物化学的原理，根据产物已知的或可能的生物合成途径、代谢调控机制和产物分子结构来进行设计和采用一些筛选方法，以打破微生物原有的代谢调控机制，获得能大量形成产物的高产突变株。

理性化筛选 初级代谢产物高产菌株的筛选： 降低终产物浓度 筛选抗反馈突变菌株 次级代谢产物（主要是抗生素）高产菌株的筛选： 利用营养缺陷型筛选 筛选负变株的回复突变株 筛选去磷酸盐调节突变株 筛选去碳源分解代谢调节突变株 筛选氨基酸结构类似物抗性突变株 筛选二价金属离子抗性突变株 筛选前体或前体结构类似物抗性突变株 筛选自身所产的抗生素抗性突变株

降低终产物浓度

3、杂交育种 真菌、放线菌和细菌均可进行杂交育种。 杂交育种——一般指两个不同基因型的菌株通过接合或原生质体融合，使遗传物质重新组合，再从中分离和筛选出具有新性状的菌株。 真菌、放线菌和细菌均可进行杂交育种。

1）常规的杂交育种 遗传标记 异核体形成 杂合二倍体的形成 染色体交换和单倍体

2）原生质体融合

A.标记菌株的筛选 供融合用的两个亲株要求性能稳定并带有遗传标记，以利于融合子的选择。 采用的遗传标记一般以营养缺陷型和抗药性等遗传性状为标记。 通过采用多种抗生素及其他药物，以梯度平板法进行粗选，再用具有抗性的抗性生物制备不同浓度的平板，进行较细的筛选。

B.原生质体的制备 在高渗透压溶液中，用适当的脱壁酶去除细胞壁，剩下的是由细胞膜包裹的原生质体。 （细菌或放线菌可用溶菌酶或青霉素处理， 酵母菌和霉菌可用蜗牛酶或其他相应的脱壁酶） 在高渗透压溶液中，用适当的脱壁酶去除细胞壁，剩下的是由细胞膜包裹的原生质体。 溶菌酶 蜗牛酶

影响原生质体制备的因素： 菌体的预处理 菌体的培养时间 酶浓度 酶解温度 酶解时间 渗透压稳定剂 用EDTA、甘氨酸、青霉素或D-环丝氨酸等处理细菌，使菌体细胞壁对酶的敏感性增强。 一般选择对数生长后期的菌体，这时细胞正在生长、代谢旺盛，细胞壁对酶解最为敏感。 一般控制在20～40℃。 充足的酶解时间 对于细菌或放线菌一般采用蔗糖、丁二酸钠； 对于酵母菌则采用山梨醇、甘露醇等； 对于霉菌则采用KCl和NaCl等。一定浓度的Ca2+、Mg2+等二价阳离子可增加原生质膜的稳定性。

C.原生质体的融合和再生 影响原生质体融合的因素： 影响原生质体再生的因素： 融合是把两个亲株的原生质体混合在一起，在融合剂PEG和Ca2+作用下，发生原生质体的融合。 原生质体融合后的重组子要成为一个无性繁殖系，首先必须再生，即能重建细胞壁，恢复完整细胞并生长、分裂。 影响原生质体融合的因素： 菌体的前处理； 菌体的培养时间； 融合剂的浓度； 融合剂作用的时间； 阳离子的浓度； 融合的温度； 融合体系的pH值等。 影响原生质体再生的因素： 菌种自身的再生性能； 原生质体制备的条件； 再生培养基成分； 再生培养条件等。

原生质体的形成率 检查原生质体形成和再生的指标： 原生质体的再生率 将用酶处理前的菌体经无菌水系列稀释，涂布于完全培养基平板上，计出原菌数A； 将用酶处理后得到的原生质体分别经如下两个过程的处理： 用无菌水适当稀释，在完全培养基平板上培养计数，由于原生质体在低渗透压条件下会破裂失活，所以生长出的菌落数为未形成原生质体的原菌数B； 用高渗液适当稀释，在再生培养基平板上培养计数，生长出的菌落数为原生质体再生的菌数和未形成原生质体的原菌数之和C。 原生质体再生率＝ C – B A－B ×100％ 原生质体形成率＝ A – B A ×100％

D.融合子的选择 融合子的选择主要依靠两个亲株的选择性遗传标记。 在选择性培养基上，通过两个亲株的遗传标记互补而挑选出融合子。 在融合体再生后，进行几代自然分离、选择，才能确定真正融合子。

原生质体融合与传统杂交方法相比有以下几个特点： 1、重组频率高并可能有几个亲株同时进行杂交； 2、可以进行种间甚至属间杂交并形成稳定的重组体，但重组 的频率比较低； 3、被灭活的原生质体进行融合后，仍可能活的重组体； 4、原生质体的形成与再生本身就可作为链霉菌的一种育种方 法。

4、基因工程技术改良菌种 体外重组DNA技术或称基因工程、遗传工程，是以分子遗传学的理论为基础，综合分子生物学和微生物遗传学的最新技术而发展起来的一门新兴技术。 它是现代生物技术的一个重要组成方面，在工业微生物学上提供了巨大的创造具有工业应用价值的生产菌株的潜力。

（1）DNA重组过程 基因的分离 DNA分子的切割与连接 载体 引入宿主细胞 重组体的选择和鉴定 外源基因的表达

（2）重组DNA技术在微生物药物菌种改良研究中的应用 提高微生物药物的单位产量 1.增加限速酶基因拷贝数,提高菌种的生产能力 2.引入抗性基因和调节基因,增加微生物药物单位产量 3.克隆抗生素的全部结构基因,改变表达体系提高产量

C. 构建能产生半合成抗生素中间体的基因工程菌 许多半合成抗生素的中间体是由一些天然产物经过化 B.阻断支路代谢，增加有效组分的含量 抗虫抗生素阿弗米丁基因工程菌的构建——阿弗米丁是十六元大环内酯的齐墩果二糖衍生物，由除虫链霉菌产生，在发酵过程中还产生一种结构差别大的大环内酯类抗生素寡霉素。 C. 构建能产生半合成抗生素中间体的基因工程菌 许多半合成抗生素的中间体是由一些天然产物经过化 学修饰获得的，但是制备工艺较为复杂。例如半合成头孢 菌素的中间体是头孢菌素C的衍生物7-ACA，或青霉素G 和V的衍生物7-ADOCA。

E. 引入血红蛋白基因，改善微生物的工业性状 D. 构建产生新化合物的基因工程菌 由于许多微生物次级代谢产物酶系的底物特异性不强，当某种抗生素的生物合成基因克隆至另一结构相似、生物合成途径有关的抗生素产生菌中，可使其产生不同于二亲株产物的具有生物活性的新化合物，即“杂合抗生素”。例如，将放线紫红素的生物合成基因导入紫红链霉菌，产生了新化合物二氢榴菌紫红素；聚酮类化合物（PK）。 E. 引入血红蛋白基因，改善微生物的工业性状 充足的氧气供给是稳定和提高发酵工业生产水平、降低生产成本的关键，传统方法是改良生物反应器及增大通气量。专性好氧菌透明颤菌中发现了血红蛋白（VHb），能促进氧气扩散到细胞末端氧化酶上，使细胞在贫氧状态下也能很好生长。

四、药源微生物及微生物药物的筛选技术 （一）药物的产生菌 （二）新药产生菌的分离 （三）新微生物药物的筛选 （四）微生物药物产生菌的菌种改良 （五）微生物药物产生菌的保藏

（五）微生物药物产生菌的保藏 1、菌种保藏的目的 按人们的不同要求，把从自然界分离到的野生型，或经过人工选育得到的变异型微生物纯种，使其存活，不丢失、不混乱、不污染、不发生或少发生变异，保持其优良性状或生理特性，使其处于休眠状态（一般使用多种方法保存）。

微生物菌种保藏的基本原理使微生物的生命活动处于半永久性的休眠状态，也就是使微生物的新陈代谢作用限制在最低的范围内。 菌种的保藏 2、菌种保藏的基本原理 微生物菌种保藏的基本原理使微生物的生命活动处于半永久性的休眠状态，也就是使微生物的新陈代谢作用限制在最低的范围内。 干燥、低温、隔绝空气是保证获得这种状态的主要措施。

3、菌种保藏的技术 有针对性的创造干燥、低温、缺氧的外界条件，是微生物菌种保藏的基本技术。 保藏时，一般利用菌种的休眠体（孢子、芽胞等），创造最有利于休眠状态的环境条件，如低温、干燥、隔绝空气或氧气、缺乏营养物质等，使菌体的代谢活性处于最低状态，同时也应考虑到经济、简便方法。 由于微生物种类繁多，代谢特点各异，对各种外界环境因素的适应能力不一致，一个菌种选用何种方法保藏较好，要根据具体情况而定。

4、菌种保藏方法

4、菌种保藏方法 A. 暂时保存（斜面传代保藏法 ） 最常用的微生物菌种保藏方法，作为菌种的暂时保藏之用。 把菌种接种到所需要的斜面培养基上，置最适温度下培养到出现丰满的菌体细胞或孢子后，放置于冰箱4—5℃保存，2—3个月转接一次，传代保藏。 传代频率 葡萄球菌属、链球菌属等间隔2周； 一般无芽胞细菌间隔3－6个月； 放线菌间隔3个月； 酵母菌和霉菌间隔4－6个月。

B. 长久保存 矿油保藏法 载体保藏法 悬液保藏法 冷冻真空干燥保藏法 干燥保藏法 液氮超低温保藏法 运用干燥、低温和隔绝空气等手段，降低微生物菌种的新陈代谢速率使菌种的生命活动处于半永久性的休眠状态，以达到长久保藏的目的。 矿油保藏法 载体保藏法 悬液保藏法 冷冻真空干燥保藏法 干燥保藏法 液氮超低温保藏法

矿油保藏法

冷冻干燥保藏

液氮超低温保藏法 菌种保藏在液氮超低温（-196℃）中，是目前比较理想的一种菌种保藏方法。 适用于各种菌种的保藏，特别适于难以冷冻真空干燥等方法保藏的菌种。 保藏期较长，菌种的变异较小。 投资费用较大，并要一个可靠的氮源。

7种常用菌种保藏方法的比较 方法 主要措施 适宜菌种 保藏期 评价 冰箱保藏法 （斜面） 低温（4℃） 各大类 约1～6月 简便 （半固体） 低温（4℃），避氧 细菌，酵母菌 约6～12月 石蜡油封藏法* 低温（4℃），阻氧 各大类** 约1～2年 甘油悬液保藏法 低温（－70℃），保护剂（15～50％甘油） 约10年 较简便 砂土保藏法 干燥，无营养 产孢子的微生物 约1～10年 简便有效 冷冻干燥保藏法 干燥、低温、无氧，有保护剂 >5~15年 繁而高效 液氮保藏法 超低温（－196℃），有保护剂 >15年 *用斜面或半固体穿刺培养物均可，一般置于4℃下。 **对石油发酵微生物不适宜。

5、菌种保藏的注意事项 菌种在保藏前所处的状态 菌种保藏所用的基质 操作过程对细胞结构的损害