第七章 蛋白质的分离、纯化和表征

一、蛋白质的酸碱性质 蛋白质是两性电解质 可解离基团：-氨基， -羧基，侧链R基团 蛋白质等电点：在某一pH值，蛋白所带正负电荷相等，即净电荷为零时溶液的pH称为该蛋白等电点。

二、蛋白质分子大小与形状 （一）根据化学组成测定最低分子量 例：肌红蛋白含铁量为0.335%，其最小分子量是多少？血红蛋白含铁量也是0.335%。试求其分子量。 解：肌红蛋白的分子量为： 100：0.335=M：56 M=100*56/0.335=16716.4 血红蛋白的分子量为： 100：0.335=M：（456） M=66865.7

（二）几种测定蛋白分子量方法 1、渗透压法：=cRT/Mr 2、测定扩散系数法:随Mr增加而降低 3、沉降法 *4、凝胶过滤法 规定10-13秒为一个单位，称为沉降系数单位，用S表示。 *4、凝胶过滤法 **5、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）法

凝胶过滤法和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）法测定蛋白质分子量 测定蛋白分子量 测定蛋白 标准蛋白 logMr=K1-K2R

三、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀 1、蛋白质溶液是一种胶体溶液； 水化作用，双电层结构 2、蛋白质沉淀 （1）盐析：加入中性盐，破坏蛋白水化层引起沉淀 （2）有机溶剂沉淀：加入极性有机溶剂，脱水化层，破坏双电层 （3）重金属盐沉淀：结合成不溶性盐 （4）加热变性

四、蛋白质分离纯化的基本原则 1、选择好的材料 2、前处理：匀浆或捣碎等 3、粗分离：盐析，有机溶剂沉等 4、细分离：凝胶过滤，离子交换等 蛋白质分离纯化的几个基本原则 四、蛋白质分离纯化的基本原则 1、选择好的材料 2、前处理：匀浆或捣碎等 3、粗分离：盐析，有机溶剂沉等 4、细分离：凝胶过滤，离子交换等

五、蛋白质的分离纯化方法 （一）根据分子大小不同： 1、透析：利用蛋白质分子不能透过半透膜，使蛋白质和其他小分子分开。 2、凝胶过滤：利用蛋白质分子大小不同将蛋白分开。

分子筛层析的工作原理 凝胶过滤的工作原理 也叫分子筛层析

（二）根据溶解度差别： 1、等电点沉淀法：等电点时蛋白质溶解度最低，不同蛋白具有不同等电点。 2、盐析法 3、有机溶剂法

（三）根据电荷不同： *离子交换层析 原理

离子交换层析的洗脱 离子交换层析的洗脱过程示意

蛋白质分离纯化的其它方法 1、亲和层析 2、疏水作用层析 3、金属螯合层析：Ni2+-柱

双缩脲(biuret)法: CuSO4与肽链的氨基结合 Folin-Phenol法: 芳香族氨基酸侧链发色 蛋白质的定量法 蛋白质的定量法 凯氏(Kjeldahl)定氮法: 浓硫酸加热降解蛋白质后测定NH3 双缩脲(biuret)法: CuSO4与肽链的氨基结合 Folin-Phenol法: 芳香族氨基酸侧链发色 紫外法: 280纳米处的紫外吸收 (1 OD280 = 1 mg/ml) Bradford法: 考马斯亮兰 ( Coomassie brilliant blue G250)与肽链结合后吸收谱变化 BCA (bicinchoninic acid)法: FDA唯一认可

习题 盐析作用 疏水相互作用 透析 *分离纯化蛋白质主要根据蛋白质的哪些性质 A 分子的形状和大小 B 粘度不同 盐析作用 疏水相互作用 透析 *分离纯化蛋白质主要根据蛋白质的哪些性质 A 分子的形状和大小 B 粘度不同 C 溶解度不同 D 溶液的pH值 E 电荷不同 *蛋白质胶体溶液的稳定因素是： A 蛋白质颗粒在溶液中进行布朗运动，促使其扩散 B 蛋白质分子表面有水膜 C 蛋白质溶液粒度大 D 蛋白质分子带有同性电荷 凝胶过滤法测定蛋白质分子量是根据不同蛋白质带电荷多少进行的。 用透析法可解开蛋白质中的二硫键。 SDS-PAGE测定蛋白质分子量的方法是根据蛋白质分子所带电荷不同。

习题 在水溶液中，蛋白质溶解度最小时的pH值通常就是它的等电点。 已知牛血清白蛋白含色氨酸0.58%(按重量算),色氨酸分子量为204。 (1)计算最低分子量； (2)用凝胶过滤测得牛血清白蛋白分子量大约为7万,问该分子中含有几个Trp残基。 一种酶分子量为360,000, 在酸性环境中可解离为二个不同成分, 其中一个成分分子量为120,000, 另一个为60,000. 大的占总蛋白的三分之二, 具有催化活性; 小的无活性. 用β-巯基乙醇处理时, 大的颗粒即失去催化活性, 并且它的沉降系数减小, 但沉降图案上只呈现一个峰. 关于该酶的结构可做出什么结论?

在某一溶液中含有三种蛋白质，其性质如下： 蛋白 相对分子量 等电点 A 40000 8.5 B 40000 5.9 C 60000 5.9 试设计一个方案分离纯化这三种蛋白质。 请分别阐述SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和凝胶过滤层析分离蛋白质的原理，并比较这两种方法分离蛋白质的异同点。

请分别阐述SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和凝胶过滤层析分离蛋白质的原理，并比较这两种方法分离蛋白质的异同点。