聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA片段

实验目的和要求 学习和掌握PCR基因扩增的原理和操作方法，并深刻理解PCR基因扩增技术在DNA操作中的重要性。本实验以含有小鼠的基因（暂定T10）的质粒pCMV-Myc-T10为模板，扩增出约800bp的产物。

2. 相关基础知识 1) 多聚酶链式反应(Polymerase Chain Reaction, PCR )：是一种对特定的DNA片段在体外进行快速扩增的方法。 1985年 Kary Mullis及同事创立。随后借助于热稳定性Taq DNA聚合酶的发现（1976年Chien等分离的热稳定性Taq DNA聚合酶），使PCR自动化成为可能；1987年Kary Mullis等完成了自动化操作装置，使PCR技术进行实用阶段。1993年度，Kary Mullis因发明了“聚合酶链式反应”而获得诺贝尔化学奖。

PCR 的特点及应用： PCR操作简便、省时、灵敏度高、对原始材料的质和量要求低。因此，广泛应用于许多领域。 基因克隆及定量、扩增特异性片段用于探针、体外获得突变体、提供大量DNA用于测序等； 遗传病的产前诊断； 致病病原体的检测； 癌基因的检测和诊断；　　 DNA指纹、个体识别、亲子关系鉴别及法医物证； 动、植物检疫； 在转基因动植物中检查植入基因的存在。

原理类似于DNA的变性和复性过程，即在高温（93-95℃）下，待扩增的靶DNA双链受热变性成为两条单链DNA模板；而后在低温（37～65℃）情况下，两条人工合成的寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板结合，形成部分双链；在Taq酶的最适温度（72℃）下，以引物3’端为合成的起点，以单核苷酸为原料，沿模板以5’→3’方向延伸，合成DNA新链。这样，每一双链的DNA模板，经过一次解链、退火、延伸三个步骤的热循环后就成了两条双链DNA分子。如此反复进行，每一次循环所产生的DNA均能成为下一次循环的模板，每一次循环都使两条人工合成的引物间的DNA特异区拷贝数扩增一倍，PCR产物得以2n的批数形式迅速扩增，经过25～30个循环后，理论上可使基因扩增109倍以上，实际上一般可达106～107倍。

2）PCR 反应系统的组成 PCR反应系统的组成主要包括： 引物、寡核苷酸、Taq DNA聚合酶、模板DNA、缓冲液。

引物： 要扩增模板DNA，首先要设计两条寡核苷酸引物,实际上就是两段与待扩增靶DNA序列互补的寡核苷酸片段，两引物间距离决定扩增片段的长度，两引物的5’端决定扩增产物的两个5’末端位置。由于引物是决定PCR扩增片段长度、位置和结果的关键， 因此，引物设计也就更为重要。

引物的设计： 长度一般最低不少于16个核苷酸，而最高不超过30个核苷酸，最佳长度为20～24个核苷酸。有时可在5’端添加不与模板互补的序列，如限制性酶切位点或增强因子等，以完成基因克隆和其它特殊需要，但要在酶切位点的5‘端加上额外的3－4个核苷酸，以确保附加的酶切位点有效。 两个引物之间不应发生互补，特别是在引物3’端，即使无法避免，其3’端互补碱基也不应大于2个碱基，否则易生成“引物二聚体”或“引物二倍体”（Primer dimer）。 (G+C）%含量引物的组成应均匀，尽量避免含有相同的碱基多聚体。两个引物中（G+C）%含量应尽量相似。 引物内部应避免内部形成明显的次级结构，尤其是发夹结构（hairpin structures）。

引物在PCR反应中的浓度一般在0.1～1μM之间。浓度过高易形成引物二聚体且产生非特异性产物。一般来说用低浓度引物经济、特异，但浓度过低，不足以完成30个循环的扩增反应，则会降低PCR的产率。

引物退火温度决定PCR特异性与产量；温度高特异性强，但过高则引物不能与模板牢固结合，DNA扩增效率下降；温度低产量高，但过低可造成引物与模板错配，非特异性产物增加。一般可根据引物的（G+C）%含量进行推测，一般实验中退火温度Ta(annealing temperature)比扩增引物的融解温度Tm(melting temperature)低5℃，可按公式进行粗略计算： Ta = Tm - 5℃= 4(G+C) + 2(A+T) -5℃(例) 其中A，T，G，C分别表示相应碱基的个数。在典型的引物浓度时（如0.2μmol/L）,退火反应数秒即可完成。

引物延伸温度的选择取决于DNA聚合酶的最适温度。一般取70～75℃，在72℃时酶催化核苷酸的标准速率可达35～100个核苷酸/秒。每分钟可延伸1kb的长度，其速度取决于缓冲溶液的组成、pH值、盐浓度与DNA模板的性质。所以根据扩增片段长度的不同来设计引物延伸的温度。对于1kb以上的DNA片段，可根据片段长度将延伸时间控制在1～7min。

寡核苷酸（dNTP） 在PCR反体系中,dNTP终浓度高于50mM会抑制Taq酶的活性，使用低浓度dNTP可以减少在非靶位置启动和延伸时核苷酸错误掺入，高浓度dNTPs易产生错误掺入，而浓度太低，势必降低反应物的产量。PCR常用的浓度为50～200μM，不能低于10～15μM。四种dNTP的浓度应相同，其中任何一种浓度偏高或偏低，都会诱导聚合酶的错误掺入，降低合成速度，过早终止反应。

Taq DNA聚合酶: Taq DNA聚合酶最早是从嗜热水生菌中提纯出来的。PCR反应混合物中，催化一典型的PCR所用酶量为2U。常用范围为1～4U/100μl。由于DNA模板的不同和引物不同，以及其它条件的差异，聚合酶的用量亦有差异，酶量过多会导致非特异产物的增加。

模板 模板的种类：单、双链DNA或RNA都可以作为PCR的样品。若起始材料是RNA，须先通过逆转录得到第一条cDNA。用质粒作模板时，线性化的比环状的效果好，但在实际操作中，往往不需要将质粒线性化，而直接用做模板。当使用高分子量的DNA（如基因组DNA）做模板时，如果用适当的酶先进行消化再作为模板，扩增效果会更好。 对于模板的用量来说，虽然PCR可以仅用极微量的样品，甚至是来自单一细胞的DNA，但为了保证反应的特异性，还应用ng级的DNA。

模板变性温度是决定PCR反应中双链DNA解链的温度，达不到变性温度就不会产生单链DNA模板，PCR也就不会启动。变性温度低则变性不完全，DNA双链会很快复性，因而减少产量。一般取90～95℃。样品一旦到达此温度宜迅速冷却到退火温度。DNA变性只需要几秒种，不需要时间过久；反之，在高温时间应尽量缩短，以保持DNA聚合酶的活力，加入Taq DNA聚合酶后最高变性温度不宜超过95℃。

PCR缓冲液: 用于PCR的标准缓冲液为10～50mM的Tris –HCl缓冲液（pH8.3）和1.5mM MgCl。在72℃时，反应体系的pH值将下降1个单位，接近于7.2。二价阳离子的存在至关重要，影响PCR的特异性和产量。实验表明，Mg2+优于Mn2+，而Ca2+无任何作用。Mg2+过量易生成非特异性扩增产物，Mg2+不足易使产量降低。首次使用靶序列和引物结合时，都要把Mg2+浓度调到最佳，其浓度变化范围为1～10mmol/L。

PCR循环次数 常规PCR循环次数一般为25～40个周期。一般是循环次数过多，非特异性背景严重，复杂度增加。当然循环反应的次数太少，则产率偏低。所以，在保证产物得率前提下，应尽量减少循环次数。

3）PCR扩增过程 在微量离心管中加入适量缓冲液、微量模板DNA、四种脱氧单核苷酸（dNTP）和耐热Taq聚合酶及两个合成DNA引物，并有Mg2+ 存在。其循环的温度取决于引物的Tm值、模板的种类以及聚合酶的耐热性。

(1)变性阶段 加热使模板DNA在高温下（90℃-95）变性，双链解链； (2)退火阶段 降低溶液温度，使合成引物在低温（35－65℃,一般低于模板Tm值的5℃左右），与模板DNA互补退火形成部分双链； (3)延伸阶段 溶液反应温度升至中温(72℃)，在 Taq酶作用下，以dNTP为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条双链在解链和退火之后延伸为两条双链。

PCR

3. 实验仪器及材料 PCR仪、台式离心机、灭菌的微量离心管、凝胶电泳系统等 TaKaRa Taq (5U/ l) 10XPCR Buffer (Mg2+ Plus) dNTP Mixture (each 10mM or 2.5mM) 模板 (10ng，实验1自提质粒) 引物（Primer 1 and 2, 10 M) 10x PCR Buffer： (100 mM Tris-HCl, pH8.3, 500 mM KCl, 15 mM MgCl2)

Insert EcoR1 Xho1 1.9kb pCMV-Myc-T10

Primer 1(From pCMV-Myc827-847): 5’TTC C A AGC TTC ACC ATG GCA TCA ATG CAG AAG C 保护性碱基 HindIII Myc tag Tm=4（G＋C）＋2（A＋T）＝ 4×12＋2×11＝700C. Primer 2(From T10 1249-1270): 5’TCG C GG ATC CAG TGG CAT CAG AGA CTT GCT AAT C 保护性碱基 BamH I Tm=4（G＋C）＋2（A＋T）＝4×11＋2×13＝700C.

PCR Mixture: Template DNA: 1 l (10ng) Primer 1: 1 l (10M) Primer 2: 1 l (10M) dNTPs: 4 l (2.5mM) Taq DNA polymerase: 0.5 l(5U/l) 10×buffer（Mg+）: 5 l ddH2O: 37.5l 50  l To Slide10

PCR条件： 94℃变性5min后开始以下循环 94℃变性反应45 sec； 65℃退火反应45 sec； 72℃延伸反应1 min； 进行30个循环； 最后72℃反应7min； 4 ℃冷却恒定。

5. PCR产物分析 取3-5l PCR产物，采用1.2％琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物的量、引物扩增的特异性。并可根据标准DNA的量粗略计算PCR产物的总量。

DNA Marker PCR结果： PCR product 学生实验结果(4l) 3.0kb 0.8kb