临床病毒学检验概述 Introduction on Clinic and Diagnostic Virology 江苏大学医学院检验学系 病原生物学教研室 周 天 戟 教 授

病毒Virus 病毒是一种形态最微小、结构最简单，仅有一种核酸 (DNA或RNA) ，专性寄生于活细胞内，以复制方式繁殖的非细胞型微生物。 形态最微小— 30~300nm 结构最简单—大分子核蛋白体 仅有一种核酸 ---不能独立完成生命活动，需活细胞内专性寄生 繁殖方式---复制 特 点

Structure model of virus

病毒的结构、组成与功能 结构 组成 化学成分 功能 核衣壳 核蛋白 病毒的基本结构 核心 DNA or RNA 构成病毒的基因组 衣壳 壳粒 　核心 DNA or RNA 构成病毒的基因组 　衣壳 壳粒 蛋白质 保护核酸、抗原性介导病毒进人宿主细胞 包膜 脂质双层膜 包膜子粒 脂类 糖蛋白 病毒的特殊结构 功能同衣壳

螺旋对称型 helical symmetry 复合对称型 complex symmetry 病毒核衣壳的对称类型 螺旋对称型 helical symmetry 20面体对称型 icosahedral symmetry 复合对称型 complex symmetry

Model of helical symmetry

Model of icosahedral symmetry

Model of various virus

病毒的复制周期 Replication cycle of virus 吸 咐（Adsorption） 穿 入（Penetration） 脱 壳 (Uncoating) 生物合成 (Biosynthesis) 装 配（Assembly） 释 放 ( Release)

Replication cycle of a virus

病毒感染的致病机理 Pathogenic mechanisms of virus infection 病毒感染对宿主细胞的直接影响Influence of viral infection on host cells 免疫病理作用 immunopathologic effect

Influence of viral infection on host cells 引起宿主细胞死亡： 杀细胞型感染 (Cytolytic infection)、 稳定状态感染 (Stable infection)、 细胞凋亡 (Apoptosis) 细胞增生与转化 (hyperplasia and transformation)： 病毒基因整合 (Integration) 病毒癌基因表达 病毒及其蛋白的慢性长期刺激 细胞成分与结构改变：包涵体、Ag、

病毒感染的实验诊断 病原学诊断（病毒及其成分检测） 病毒的分离培养与鉴定 病毒的形态学检查：CPE、包涵体、电镜 病毒Ag检测: IFA、ELISA 病毒核酸检测: PCR、RT-PCR、核酸杂交 血清学诊断（病毒抗体检测） 单份血清测定IgM －－早期诊断 双份血清测定IgG －－ 回顾性诊断 快速诊断

病毒学检查标本的采集与送检 病毒标本采取原则：急性期采取，无菌操作与抗菌处理，防止病毒灭活 病毒形态学检查：血液、尿、粪便、组织切片、脱落细胞涂片等 病毒分离培养：血液、尿、粪便、组织 血清学诊断：血清

病毒的形态学检查方法 光镜 电镜 标本：脱落细胞、组织切片 病毒形态与结构观察：超离心浓缩法、免疫电镜法、磷钨酸负染法、 方法：HE染色 细胞病变效应(Cytopathic effect, CPE)、包涵体（Inclusion Bodies）观察、病毒Ag检测（IFA） 电镜 病毒形态与结构观察：超离心浓缩法、免疫电镜法、磷钨酸负染法、 病毒与细胞结构： 超薄切片、冰冻蚀刻法： 病毒Ag超微定位：胶体金免疫标记法

各种病毒的CPE 单纯疱疹病毒在HEK细胞中的CPE 巨细胞病毒包涵体

HSV在非洲绿猴肾（Vero）细胞引起的典型致病作用

Cytopathic effects cell rounding due to HSV; syncytium formation or cell fusion due to RSV in human embryo fibroblast cells

病毒的包涵体（Inclusion Bodies） 狂犬病毒包涵体 巨细胞病毒包涵体

细支气管炎患儿鼻咽细胞直接免疫荧光试验（RSV） CMV early antigen demonstrated in nuclei of human embryo fibroblasts by IFA 急性巨细胞病毒感染者外周嗜中性细胞的直接免疫荧光试验

脊髓灰质炎病毒 天花病毒 电镜负染色病毒的形态 嗜菌体 轮状病毒

Influenza virus 80~120 nm

Virions of vesicular stomatitis virus (VSV), the helical nucleocapsid

Hepatitis B virus, HBV

Hantavirus inside the cell

A focus of CMV infection in human embryo fibroblast monolayer cell culture

Human embryo lung fibroblast cell infected by cytomegalovirus (CMV)

The envelope glycoprotein I in VZV labeled with McAb and anti-mouse IgG conjugated with 15 nm colloidal gold

病毒的培养方法 方法 用 途 优 点 缺 点 动物 观察致病性 简便易行 阳性率低 鸡胚 分离培养 部分病毒不敏感 细胞 适应性强，易于观察 一定条件

鸡胚接种

病毒的细胞培养方法 种类 优点 缺点 按来源和传代次数 原代细胞 性质同体内 操作烦琐 二倍体细胞 性质似体内 有限代数 传代细胞系 分类方法 种类 优点 缺点 按来源和传代次数 原代细胞 性质同体内 操作烦琐 二倍体细胞 性质似体内 有限代数 传代细胞系 无限传代 性质各异 按培养特性 贴壁细胞 单层易观察 细胞数量少 悬浮细胞 细胞数量多 不易观察

细胞培养上病毒增殖的观察 液体标本中病毒的测定 细胞病变效应(cytopathic effect, CPE)： 红细胞吸附试验(Erythrocyte adsorption） 干扰试验(Interference assay) 免疫荧光测定（Immunofluorescence assay, IFA） 电镜观察病毒颗粒 液体标本中病毒的测定 病毒血球凝集与血球凝集抑制试验(Viral Hemagglutination and Hemagglutination inhibition test 病毒抗原测定： ELISA, Western blot 病毒酶活性测定：reverse transcriptase of HIV 病毒蛋白分析： SDS-PAGE 病毒核酸分析：琼脂糖凝胶电泳

红细胞吸附试验 Hemadsorption test Glycoproteins (hemagglutinin, HI) of some enveloped viruses can adsorb erythrocytes of some animals, e.g. influenza virus/ chicken erythrocytes Erythrocytes of chicken added onto influenza virus-infected chicken embryo fibroblast cells for 1h incubation and washed for removal of unabsorbed erythrocytes and observed under microscope

病毒数量和感染性测定 ID50 或 TCID50：病毒感染鸡胚、动物或细胞后，引起 50% 发生死亡或病变的最小量，称 50% infectious dose 或 50% tissue cell infectious dose，不可准确测定感染性病毒颗粒的数量，为半定量。 蚀斑试验：

Plaque formed in cells infected by animal virus 蚀斑试验：病毒感染单层细胞后，产生的局限性病灶，称蚀斑，每一蚀斑是由一个感染性病毒颗粒形成的，称蚀斑形成单位(plaque forming unit, PFU)，病毒悬液中的感染性病毒量以每毫升的蚀斑形成单位来表示，可准确测定感染性病毒颗粒的数量。 Plaque formed in cells infected by animal virus

病毒的血清学诊断 特异性IgM：捕获ELISA 特异性IgG： 间接ELISA

课外阅读书目 杨占秋, 《诊断和实验病毒学》，郑州大学出版社，2002 中国生物技术发展中心, 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所编著，《病毒学方法》， 科学出版社， 2012 张卓然, 倪语星, 尚红主编，病毒性疾病诊断与治疗，科学出版社， 2009