几种基本蛋白质实验技术

SDS-PAGE Western blotting Southwestern blotting Immunochemistry

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 基本原理：根据蛋白质分子量不同分离复杂蛋白质成分。

SDS-PAGE试剂 1.制备凝胶试剂： 丙烯酰胺（单体） 亚甲双丙烯酰胺（胶联剂） 二者比例29 ：1 母液浓度30% 过硫酸铵（引发剂） N,N,N,’N’-四甲基乙二胺（ TEMED） (加速剂) 十二烷基磺酸钠（SDS）（阴离子变性剂）

2.蛋白上样缓冲液 3.电泳缓冲液  4.考马斯亮蓝R250染色液 5.脱色液

SDS-PAGE实验过程流程如下： 凝胶制备 蛋白样品制备及上样 电泳 卸胶 染色 脱色

凝胶制备

梳子孔 浓缩胶 分离胶

分子量范围与凝胶浓度 分子量范围(KDa) 凝胶浓度范围 >100 4%-7% 10-100K 8%-15% >100 4%-7% 10-100K 8%-15% <10 20%-30%

12% SDS-PAGE凝胶成分（15ml） 试剂及浓度 12%分离胶 纯水 4.9ml 30%丙烯酰胺 6.0ml 试剂及浓度 12%分离胶 纯水 4.9ml 30%丙烯酰胺 6.0ml 1.5M Tris-Cl（pH8.8） 3.8ml 10%SDS 150ul 10%过硫酸胺 150ul TEMED 4ul

5% SDS-PAGE凝胶成分（6ml） 试剂及浓度 5%浓缩胶 纯水 4.2ml 30%丙烯酰胺 0.99ml 试剂及浓度 5%浓缩胶 纯水 4.2ml 30%丙烯酰胺 0.99ml 1.0M Tris-Cl（pH6.8） 0.75ml 10%SDS 60ul 10%过硫酸胺 30ul TEMED 3ul

蛋白样品制备及上样 每个加样孔所上样蛋白总量要适中 过高:蛋白条带扭曲 过低:蛋白条带染色浅 蛋白样品需与上样缓冲液混合(1:1) 2×SDS凝胶上样缓冲液(100mM/L Tris-Cl(pH6.8)， 200mM/L DTT，4%SDS，0.2%溴酚蓝，20% 甘油) 上样前样品需要沸煮3--5分钟

电泳 上层胶电压小(80V) 使蛋白在浓缩胶和分离胶的交界处浓缩呈线状 下层胶电压加大(150V) 使蛋白样品充分分开

卸胶: 防止凝胶破损 染色: 考马斯亮蓝染色 考马斯亮蓝R250 1 卸胶: 防止凝胶破损 染色: 考马斯亮蓝染色 考马斯亮蓝R250 1.25g，甲醇225ml，冰醋酸 50ml，MilliQ水定容500ml。 脱色:甲醇150ml，冰醋酸50ml，MilliQ水300ml。

Western blotting 基本原理: 将SDS-PAGE分离的蛋白质转移至硝酸纤维素膜(nitrocellulose membrane)上,在膜上进行固相免疫化学染色,原位显示蛋白质带,从而在已知分子量的基础上对蛋白质进行定性、定量分析。

Western blotting实验过程流程如下： SDS-PAGE（不经染色） 电场转移 免疫化学染色

电场转移 切下需转移凝胶，再剪下一块与凝胶块等大的硝酸纤维素膜和两块厚滤纸，均浸泡于电转移缓冲液中（25mM Tris，192mM glycine，0.1%SDS，20%甲醇 ） 至少30分钟。然后用塑料框架固定如“三明治”样。

（ + ） （— ） 固定架 滤纸 NCM 凝胶

SDS-蛋白质复合物在电场的作用下向正极移动，达到NCM，以共价键结合在NCM上。 根据目的蛋白分子量大小设定电流（恒流）或电压（恒压）大小。

电转移操作时应注意： 凝胶、NCM 及滤纸一定要在电转移缓冲液中浸泡； 凝胶、NCM 及滤纸大小应一致，以防电转时短路（半干转时）； 一定要赶走“三明治”各层间的气泡； 电转移缓冲液中的甲醇（可促进蛋白质与NCM的结合）最好用前加入。

转移完成后，可用丽春红染NCM,观察转移的效果；同时，转膜后的凝胶也可以进行银染或者考染，评价转移的效果。

丽春红染色NCM (2-DE)

银染转膜后的凝胶（2-DE）

免疫化学染色 试剂: TBS（100mmol Tris，150mmol Nacl） 复性液 (0.3% Triton X-100于TBS中) TBST漂洗液（0.05% TWeen-20于TBS中)

免疫化学染色过程: 复性 把硝酸纤维素膜放入复性液中,复性5min后, Milli-Q水冲洗两遍； 封闭 把复性过的硝酸纤维素膜放入封闭液，平放于摇床上室温孵育1-2小时，或4℃放置过夜； 洗涤 弃去封闭液，用TBST洗涤3次, 10min/次； 一抗孵育 一抗与封闭液按比例混匀后,移至塑料袋中，将硝酸纤维素膜放入其中, 密封塑料袋, 于摇床上室温温育2小时； 洗涤 TBST充分3~4次,10min/次；

二抗孵育 将辣根过氧化物酶二抗用封闭液稀释后, 将硝酸纤维素膜加入其中,室温摇床上放置2小时； 洗涤 TBST充分3~4次,10min/次； DAB显色 将二抗孵育后的硝酸纤维素膜放入显色液中,轻轻摇动3~10min,待膜上可见明显的显色斑点。

Southwestern blotting 该方法是结合了Western blotting和southern blotting两种试验方法而发展起来的检测与特异DNA序列相结合的DNA结合蛋白的方法. 基本原理: 细胞核蛋白提取物经SDS-PAGE后,转移至NCM上,然后用标记的DNA探针检测转移至膜上的蛋白质。

Southwestern blotting实验过程流程如下： SDS-PAGE 电场转移 标记的DNA探针与NCM上蛋白质的杂交

Immunochemistry 基本原理： 应用抗原与抗体结合的免疫学原理，检测细胞或组织中多肽、蛋白质及膜表面抗原和受体等大分子物质的存在与分布。

免疫组化法一般实验过程 组织固定、石蜡包埋、切片、脱蜡 过氧化氢灭活内源性过氧化物酶 微波修复抗原 封闭 一抗、二抗孵育孵育 DAB显色 苏木素—伊红（HE）复染

Key points 蛋白质组及蛋白质组学概念 双向电泳的原理 比较蛋白质组学实验流程 几种功能蛋白质组学研究方法的基本原理 Western blotting的基本原理及操作中的注意事项

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