胚胎原位杂交检测基因的时空表达模式
研究目的： 用来检测特定基因在胚胎发育时期的表达模式
实验原理 mRNA Dig 标记的RNA探针 BCIP+NBT 显色反应
实验组成部分 PCR 基因克隆——T载体——酶切线性化——体外转录合成探针
实验组成部分 1. Dig 标记的RNA 探针的制备 混匀后37℃ 2.5小时 试剂及材料 体积（20ul） 溶于DEPC处理水中的线性化质粒 >1ug in 10ul 水中 含DIG标记的NTP Mix 1ul 转录缓冲液（10×） RNA聚合酶（SP6、T7或T3） 1ul(20 U/μl) 混匀后37℃ 2.5小时 加2ul DNase 1 (RNase-free)，37℃ 20分钟，消化DNA模板 加入1ul EDTA（pH8.0）终止反应。
原位杂交步骤 1. 胚胎的固定和蛋白酶的消化 4%PFA固定胚胎，酒精梯度脱水后保存于-20度。 将保存于无水乙醇的胚胎经90%乙醇-70%乙醇-50%乙醇-30%乙醇-DEPC处理的水-PBS梯度水化 蛋白酶K消化
2. 杂交 （1）预杂交 （ 2）探针杂交+探针 60 ℃ 2-36h
回收探针和洗涤胚胎 Wash1 Wash3 Wash4 杂交液 60°C 15 min 5×SSC 50% 甲酰胺 0.5%SDS 0.05%Tween-20 20 min×2 Wash2 2×SSC 0.4%SDS Wash3 0.1%Tween-20 20min×2 Wash4 0.2×SSC
4、DIG抗体孵育 加入MAB，6min。 Blocking buffer 1hr； Antibody solution （1: 2000稀释）4°C 过夜。
5. 洗脱和显色 吸出抗体，用MAB 洗脱胚胎至少4次，每次30 min 用NBT/BCIP 显色，室温，放入暗处，10 分钟- 24 hr 镜检观察信号
6. 显色终止和观察拍照 PBS 或甲醇终止显色 PBS或甘油中观察拍照