种子检验学实验 种子检验学 马守才 博士/副教授 西北农林科技大学农学院 马守才 博士/副教授 西北农林科技大学农学院 Email:mashoucai@nwsuaf.edu.cn

实验四 品种真实性的SSR分子标记分析 一、目的要求 (2)学会识别分子标记电泳图谱或照片图谱，能识别和判断品种图谱的差异。

二、实验原理 简单重复序列(simple sequence repeats,SSR)分布于小麦基因组的不同位置上，不同品种每个位点上重复单位数目及序列可能不同。由于每个重复序列两侧的序列是高度保守和单拷贝的，因而可以根据两侧的序列设计一对特异引物，利用PCR技术对重复序列进行扩增，得到的PCR产物在电泳过程中的电场作用下，由于分子量大小不同得到分离，经硝酸银染色或者荧光染料标记检测区分开。 3

由于不同品种的遗传组成不同，所以根据引物DNA序列存在差异或引物结合部位之间的DNA片段大小存在差异，即可鉴定小麦品种。 4

三、材料和用具 （见实验过程） 四、方法和步骤 (一) 种子或幼苗DNA提取纯化 1.CTAB法 2.SDS法 3.试剂盒法 5

（二）PCR扩增 8× PCR扩增反应体系 反应组分 原浓度 终浓度 反应体积（10L） ddH2O（L） － 3.05 24.4 10×Buffer （不含Mg2+） 10× 1× 1.0 8 MgCl2(mmol/L) 25 1.25 0.5 4 dNTPs(mmol/L) 10 0.2 1.6 Tag酶U/L 2 0.05 U 0.25 引物(mol/L) 2.0 16 DNA(ng/L) 50 15 3.0 ---- 6

10× 简化PCR扩增反应体系 反应组分 原浓度 终浓度 反应体积（15L） ddH2O（L） － 4.5 MIX 2 0.05 U 7.5 引物(mol/L) 1.25 0.25 2.0 DNA(ng/L) 50 15 1.0 ---- 7

退 火：50-68℃（依据引物的退火温度改变） 45s， 延 伸：72℃60s，进行30次循环； 终延伸：72℃ 10min。 反应程序 预变性：94℃ 5min； 变 性：94℃30s， 退 火：50-68℃（依据引物的退火温度改变） 45s， 延 伸：72℃60s，进行30次循环； 终延伸：72℃ 10min。 扩增产物于4℃保存 8

（三）扩增产物分离----变性PAGE垂直板电泳 PCR扩增反应体系 （三）扩增产物分离----变性PAGE垂直板电泳 1.制胶 玻璃板反复擦洗干净，再用双蒸水、75%乙醇分别擦洗两遍。 1mL亲和硅烷工作液，均匀涂在长玻璃板上；将1mL剥离硅烷工作液，均匀涂在带凹槽的短玻璃板上。（防止相互污染） 玻璃板彻底干燥后，将0.4mm 厚的塑料隔条整齐放在长玻璃板两侧，盖上凹槽短玻璃板，夹子固定； 9

待胶室灌满后，在凹槽处将鲨鱼齿梳的平齐端插入胶液约5 mm～6 mm，胶聚合时间不少于1.5h。 PCR扩增反应体系 取80mL 6%聚丙烯酰胺变性凝胶溶液，加入60LTEMED、180L 10%过硫酸铵，轻轻摇匀，将胶灌入玻璃胶室，灌胶过程应防止气泡出现。 待胶室灌满后，在凹槽处将鲨鱼齿梳的平齐端插入胶液约5 mm～6 mm，胶聚合时间不少于1.5h。 胶聚合后,清理胶板表面溢出的胶液,轻轻拔出梳子,用清水洗干净备用。 10

取10l扩增产物，加入2L 6×加样缓冲液，混匀。 在PCR扩增仪上运行95℃变性5min， 2.变性 取10l扩增产物，加入2L 6×加样缓冲液，混匀。 在PCR扩增仪上运行95℃变性5min， 取出立即置于冰上，冷却10min以上后供备用。 11

电泳正极槽（下槽）加入0.5×TBE缓冲液600mL，负极槽（上槽）加入0.5×TBE缓冲液600mL，拔出样品梳; PCR扩增反应体系 3.电泳 将胶板安装于电泳槽上， 电泳正极槽（下槽）加入0.5×TBE缓冲液600mL，负极槽（上槽）加入0.5×TBE缓冲液600mL，拔出样品梳; 在1800V恒压预电泳（10～20）min，用塑料滴管清除加样槽孔气泡和杂质，将样品梳插入胶中1mm-2mm。 每一个加样孔加入5L变性样品，在1800V恒压下电泳。 12

将粘有凝胶的长玻璃板胶面向上浸入“固定/染色液”中，轻摇染色槽，使“固定/染色液”均匀覆盖胶板，染色5 min～10 min。 PCR扩增反应体系 4.染色 将粘有凝胶的长玻璃板胶面向上浸入“固定/染色液”中，轻摇染色槽，使“固定/染色液”均匀覆盖胶板，染色5 min～10 min。 将胶板移入水中漂洗30 s～60 s。 再移入显影液中，轻摇显影液槽，使显影液均匀覆盖胶板，待带型清晰， 将胶板移入去离子水中漂洗5 min，晾干胶板，放在胶片观察灯上观察记录结果，拍照保存。 13

扩增片段大小的读取，统一采用两段式数据记录方式。 纯合位点数据记录为X/X，小片段数据在前，大片段数据在后，缺失位点数据记录为0/0。 PCR扩增反应体系 4.数据分析 扩增片段大小的读取，统一采用两段式数据记录方式。 纯合位点数据记录为X/X，小片段数据在前，大片段数据在后，缺失位点数据记录为0/0。 注：非纯合SSR位点的数据记录为X/Y（其中X、Y 分别为该位点两个等位基因的扩增片段大小）。 14

(2)简述SSR分子标记测定品种真实性的原理与步骤 （3)实验后思考 五、作业 (1)统计位点差异记录的结果 (2)简述SSR分子标记测定品种真实性的原理与步骤 （3)实验后思考 15

Tris碱 60.55g溶于适量水中，加HCl调pH至8.0，加水定容至500mL，121℃ 高压灭菌20 min。 附：试剂配置 A1 DNA提取 （1）0.5 mol/L EDTA溶液 Na2EDTA.2H2O 186.1g溶于800mL水中，加固体NaOH调pH至8.0，加水定容至1000mL，121℃ 高压灭菌20 min。 （2）1 mol/L Tris-HCl溶液 Tris碱 60.55g溶于适量水中，加HCl调pH至8.0，加水定容至500mL，121℃ 高压灭菌20 min。 （3）5 mol/L NaCl溶液 固体NaCl 146.1g，加水定容至500mL，121℃ 高压灭菌20 min。 16

称取KAC 49.67g，用水溶解，冰乙酸调整PH至5.2，定容至100ml，121℃ 高压灭菌20min。 （6）1×TE 缓冲液 （4）CTAB提取液 5mol/L NaCl 280 mL、20mL β-巯基乙醇（C2H6OS）、CTAB 20g、1mol/L Tris-HCl 100mL和0.5mol/L EDTA 40mL，加水定容至1000mL，4℃贮存。 （5）5 mol/L KAC 称取KAC 49.67g，用水溶解，冰乙酸调整PH至5.2，定容至100ml，121℃ 高压灭菌20min。 （6）1×TE 缓冲液 1mol/L Tris-HCl 5mL和0.5mol/L EDTA 1mL，加HCl调pH至8.0，加水定容至500mL，121℃ 高压灭菌20min。 17

A2 PCR扩增 （1）dNTP 用超纯水分别配制dATP、dGTP、dCTP、dTTP终浓度100mmol/L的储存液，分别用0.05mol/L的 Tris碱调整PH值至7.0。各取80L混合，用超纯水480L定容至终浓度10mmol/L each的工作液。 （2）SSR引物 用1×TE分别配制上游引物、下游引物终浓度均为100mol/L的储存液，从100mol/L的储存液中吸取上下游引物各12.5L混合，再加入975L 1×TE混匀成1.25mol/L的工作液。 18

去离子甲酰胺98mL、0.5mol/L EDTA 2mL、溴酚兰0.25g和二甲苯青0.25g混合摇匀，4℃备用。 (1) 6×上样缓冲液 去离子甲酰胺98mL、0.5mol/L EDTA 2mL、溴酚兰0.25g和二甲苯青0.25g混合摇匀，4℃备用。 (2) 0.5mol/L EDTA溶液 称取18.61 g二水合乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2·2H2O）溶于水中，用NaOH颗粒将pH调至 8.0，加水定容至100 mL。在121 ℃灭菌20 min。 (3) 10×TBE缓冲液(PH=8.3)（1000 毫升）： 108g Tris base，55g硼酸 ，7.44gNa2EDTA·2H2O，加去离子水溶解后定容，室温保存备用。 19

(4) 6%聚丙烯酰胺凝胶母液(6%胶)（1000 毫升）：尿素420g、10×TBE缓冲液50mL、丙烯酰胺（C3H5NO）57 g、甲叉双丙烯酰胺（(H2C=CHCONH)2CH2）3g，加水定容至1000mL。用大漏斗过滤，所配胶保存在棕色瓶中，置于 4℃冰箱或室温备用。 20

(5) 1%亲和硅烷工作液：10ul 亲和硅烷，10ul冰醋酸，980ul无水乙醇混合摇匀。 (6) 2%剥离硅烷的配制：2ml 剥离硅烷，98ml三氯甲烷混合摇匀。 （7) 10%过硫酸铵溶液 称取0.1 g过硫酸铵（(NH4)2S2O8）溶于1 mL水中。保存于冰箱冷冻室中备用。 （8) 0.5×TBE工作液 10×TBE缓冲液250mL，加水定容至5000mL。 21

硝酸银（AgNO3）2 g、75％乙醇133 mL、99%乙酸6 mL，加水定溶至1000 mL。 （2) NaOH显影液 （1)固定液/染色液 硝酸银（AgNO3）2 g、75％乙醇133 mL、99%乙酸6 mL，加水定溶至1000 mL。 （2) NaOH显影液 氢氧化钠（NaOH）20 g，溶于1 000 mL的蒸馏水中。使用前加入6 mL的甲醛（CH2O）溶液。 22