微生物分類學及系統發育 大綱 19.1 一般介紹和概況 19.2 微生物的進化和多樣性 19.3 分類等級 19.4 分類系統 19.5 分類學中使用之主要特性 19.6 微生物系統發育的評估 19.7 生命的主要劃分 19.8 伯杰氏系統細菌學手冊 19.9 原核系統發育和多樣調查

一般介紹和概況 GENERAL INTRODUCTION AND OVERVIEW 分類學Taxonomy(希臘語taxis安排或順序; nomos法則或nemein分類或治理)：定義為生物分類的科學 包含分類、命名和鑑定 分類學的重要性 讓人們整理有關生物大量的知識，分類愈精細，系統信息愈豐富和愈有用 對相似生物的知識，對進一步研究推測和假設 將微生物給予精確命名、分成有意義和有用之類群 對微生物精確鑑定是必要的

系統學systematics (系統分類學) 以分析生物特徵並按順序排列為最終目的的科學研究 任何生物特性的研究是系統學的一部分 涵蓋了形態學、生態學、流行病學、生物化學、分 子生物學和生理學 微生物分類使用新的分子技術 也介紹許多傳統方法 主要以伯杰氏系統細菌學手冊Bergey‘s Manual of Systematic Bacteriology，簡稱BMSB 以16S rRNA 基因序列比對為基礎建構系統，做成分類層級，並把原核生物分為古生物域和細菌域，兩域分別包含2門和 23 門

微生物的演化和多樣性 MICROBIAL EVOLUTION AND DIVERSITY 地球年齡估計約有46億年 疊層石 (stromatolites)和沉積岩中之化石遺骸發現原核細胞約有35至38億年 微生物化石清晰地在20億年之岩石上 現代疊層石由藍細菌所形成 最早原核生物可能是厭氧性 藍細菌和產氧之光合作用菌大概在25-30億年或更早 隨著氧變得較豐富，微生物多樣性大大增加

1977 Carl Woese等學者對原核生物細胞rRNA 序列研究後提出 原核生物應分為兩個類：群細菌、古細菌 真核生物 這三個基本類群稱為『域』domains，在門和界水準之上 真核生物有甘油脂二酯膜脂glycerol fatty acy diesters 細菌生物有diacyl glycerol diesters 古細菌diether or diglycerol tetraether lipid (醚鍵)

現代真核生物細胞起源於14億年前的原核生物(有些化學數據證明在27億年前)，兩個假說 核、粒線體 和葉綠體是由原生質膜內陷形成包含遺傳物質的雙層膜結構形成的 葉綠體，粒線體和現代細菌之間的相似性源自於原核生物保留性的胞器緩慢的改變 內共生假說(endosymbiotic hypothesis) 真核細胞祖先可能由古代的細菌和古生菌融合而形成 失去了細胞壁之G(-)宿主細胞吞了古生細菌形成共生 古生菌喪失了它的細胞壁和原生質膜 宿主細菌形成膜折疊，宿主基因體轉移至古生菌中，形成核和內生網狀 在形成真核生物基因體時，細菌和古生菌基因可能皆喪失

很多人認為古生菌和真核生物比親緣關係更近，認為真核生物直接從古生菌分化而來 葉綠體的可能源自光合細菌 藍細菌是葉綠體最可能的祖先 粒線體來源於原始真核生物和好氧呼吸真細菌的共生 可能祖先：農桿菌屬、根瘤菌屬和立克次氏體屬 內共生的證據 藍細菌定居在雙生鞭毛原生生物，作為寄主葉綠體 內共生體稱為藍色小體 與藍細菌在光合作用色素系統和存有類似肽聚糖層的構造 缺少脂多糖外層膜特徵 進化成葉綠體

分類等級TAXONOMIC RANKS 種、屬、科、目、綱 和門 每個水平或等級的微生物類群的命名都有特定字尾特徵 常使用非正式的名稱：如紫細菌、螺旋體、甲烷氧化菌、硫酸還原菌和乳酸菌 微生物分類中基本分類類群是種species 與高等生物研究的分類學家定義種的概念不同 高等生物的種是一群彼此雜交能繁殖或潛在的雜種繁殖的自然群體，對能有性生殖的生物是很好的定義 但對不是有性繁殖的微生物則不宜 原核生物的種是根據表型和基因型的不同而定義 原核生物的種是菌株的一個集合，這些菌株有許多共同穩定特徵而與他類菌株有顯著的區別

此定義非常主 觀 更精確的定義。一個種(基因型種)是有相似G +C組成和有70%或以上之DNA雜交實驗判定之集合 由於基因體序列之數據增加，種或許可以定義為具有相同序列 種可能是生物其主要管家基因housekeeping gene(所有細胞皆需之基因，其通常持續表達)具有相同序列之集合 菌株(strain) 在一個特定分類學中至少與其他一些群體可以區別之生物群體，來自單一生物或純培養物的分離株

一個種內其菌株間在許多方面上可能有小差異 變種(biovars) 是生化或生理上有差異之各色各樣的原核菌株 形態變種(morphovars)是指形態上不同 血清變種 (serovars)則指具有獨特抗原特性 模式菌株(type strain) 通常是首先被研究的菌株，其特徵比其他菌株瞭解得多，它不 一定是最具代表性的菌株 模式種 (type species) 種的模式菌株：是命名的模版或擁有種名 每一個種都屬於一個屬(genus) ，將種置於一個屬有相當主觀，有些分類學家也許不同意屬的組成

微生物學家採用雙名系統(binomial system)命名微生物 由瑞典植物學家Carl von Linne所提 系統為拉丁 化，斜體名稱分為兩部分 第一個字母大寫是屬名，第二個字母小寫Escherichia coli 種名常代表特定性質，是穩定的，某一特定生物最早的特定性質有優先權 如果由於新的信息把某一個生物分到另一屬中，而改變屬名 根據 rRNA分析和其他特徵，鏈球菌屬(Streptococcus)分為 2個新屬，腸道球菌屬(Enterococcus)和乳酸球菌屬 (Lactococcus) 糞鏈球菌(Streptococcus faecalis)現在為糞腸球菌(Enterococcus faecalis) 菌名常被縮寫，屬名用一個大寫字母表示，例如E. coli，文章中第二次出現菌名時才可縮寫，第一次出現還是要寫全名

分類系統 CLASSIFICATION SYSTEMS 表徵分類法Phenetic Classification 根據整個相似性將生物分組在一起形成表型系統 比較更多的性狀所建立之分類，由許多共同特徵的生物構成一個單獨類群或分類單位 依據可能演化關係分組在一起形成系統發育系統 數值分類法Numerical taxonomy 依據它們的特徵狀況以數值方法將分類單位分成類群 應該比較至少50個特徵，幾百個更合適 其特性包括許多不同性質的數據：形態學的、生物化學的和生理學的 可比較如RNA和蛋白質等大分子之序列

系統發育分類法Phylogenetic Classification 系統建立於演化關係上，而不表徵的相似性 缺少好的化石記錄，對於證明原核生物和其他微生物是很困難 直接比較遺傳物質和基因產物RNA或蛋白質 分類學中使用之主要特性 MAJOR CHARACTERISTICS USED IN TAXONOMY 經典(傳統)特性Classical Characteristics 分子特性Molecular Characteristics

傳統特性 形態特性Morphological Characteristics 形態學容易研究和分析 形態比較很有價值，因為構造特徵由許多基因所表達，形態相似性常常是系統發育關係密切 光學顯微鏡、穿透式和掃描式電子顯微 鏡 生理和代謝特性 Physiological and Metabolic Characteristics 生理和代謝特性直接和微生物酵素和轉運蛋白的本質和活性有關 蛋白是基因產物，分析這些特性可以提供微生物基因體間的間接比較

生態特性Ecological Characteristics 自然界中的生態特性影響 微生物與其環境之關係 生命循環類型，天然共生關係，對特定宿主致病能力，和棲息地喜好之要求，如溫度、pH、氧氣和滲透濃度 遺傳分析Genetic Analysis 大多數真核生物能行有性繁殖，遺傳分析在分類上重要，用有性繁殖定義種 經由轉化作用transformation和接合作用conjugation交換染色體基因 轉化作用可在不同原核生物『種』間發生，但在『屬』間則非常少。兩個菌株之間發生轉化作用顯示它們關係近

埃希氏菌屬Escherichia能與沙門氏菌屬Salmonella和志賀氏菌屬Shigella接合 不能與變形菌屬Proteus和腸桿菌屬Enterobacter接合 前3個 屬彼此間的關係近於變形菌屬和腸桿菌屬的關係 質體對分類將有重要影響，但最好依據 許多特性進行分類 分子特性Molecular Characteristics 蛋白質的比較Comparison of Proteins 蛋白質的胺基酸序列是直接反應mRNA序列，與基因結構緊密相關，比較不同微生物蛋白質對分類學上很有用

最直接方法是測定有相同功能蛋白質的胺基酸序列 相同功能蛋白質的序列相似，它們的生物之親緣關係可能較近 由於蛋白質測序緩慢又昂貴，所以經常採用許多間接方法比較蛋白質 研究種和亞種的親緣關係時，可用蛋白質電泳移動率 免疫學技術用於比較不同微生物的蛋白質 酵素的物理、動力和調控特性已用於分類學研究

核酸鹽基組成Nucleic Acid Base Composition 第一種技術，測定DNA鹽基組成 在雙股DNA中A與T配對，和G與C配對，因此DNA中的(G + C)/(A + T)比值或G+C含量(G+C content) ， G + C百分比反應鹽基序列 以DNA解鏈溫度(melting temperature， Tm)測定，當有50%雙股DNA分開成單股時的溫度稱為熔解溫度 雙股DNA中GC有3個氫鏈、AT有2個氫鍵連接。當DNA含高G+ C含量，其含有較多氫鏈，要在更高之溫度下才能分開，因而其熔點較高

在260 nm紫外光吸光度隨著DNA 雙鏈分開而升高 上升曲線的中間點 即為解鏈溫度 直接測定G+C含量 DNA的密度隨G+C含量直線增加，以CsCl2密度梯度離心即可得知 動物和高等植物DNA之G+C含量平均約為40%，介於30%至50%之間 真核和原核微生物DNA之G+C含量變異很大 原核生物G+C含量約25%至80%之間

兩種微生物G+C含量差異大於10%，代表它們的基因體有較大之鹽基序列差異 G+C含量非常相似的生物，其DNA鹽基序列也可能差異很大 只有在兩種微生物表型也相似，才能認為它們相似顯示它們親緣關係近 微生物的分類上，同屬若G+C含量差異太遠，這個分類單元可能應該再劃分 不同屬之間G+C含量，可以改變非常大，但同一屬內改變量常小於 10%

核酸雜交Nucleic Acid Hybridization 將兩種微生物DNA放在一起，加熱讓雙股到解離然後降溫，控制溫度可得到不同的結果 只要兩段DNA互補即可形成雙股，不一定是要與原來互補的那一股配對 結合有非放射性 DNA鏈之硝酸纖維膜與32p、3H或14C放射性標記的單股DNA片斷 當放射性片斷與膜結合之單股DNA雜交之後，除去未雜交單股DNA，測定其放射性 放射性的量越強表示親緣越近 DNA-DNA雜交僅用於研究親緣關係近的微生物 親緣較遠的生物則以放射性核糖體或tRNA為材料之DNA-RNA 雜交實驗來進行比較

核酸定序Nucleic Acid Sequencing 原核生物核糖體50S和30S次單元分離出之5S和16S rRNA序列 rRNA是研究微生物進化和相互關係之理想材料 所有微生物必要之主要胞器 功能在所有核糖體中相同 結構隨時間改變非常慢，可能是恆定和必要功能所致 rRNA包含可變和穩定序列，所以親緣關係近和非常遠的微生物都能比較

rRNA序列的測定 分離和純化RNA ↓ 合成互補 DNA (cDNA) （引子是與保守rRNA序列互補） 擴增cDNA cDNA序列定序 反推rRNA序列 細菌基因體 16S rDNA 可以直接以PCR放大，然後定序 反轉錄酵素 聚合酵素鏈式反應(PCR)

微生物系統發育的評估ASSESSING MICROBIAL PHYLOGENY 分子計時器Molecular Chronometers 核酸和蛋白質的序列隨時間而改變，而稱此為分子計時器 1965由 Zuekerkandl和Pauling提出此觀念 許多rRNA序列和蛋白質隨時間改變，而不會破壞或極少改變它們的功能 用分子計時器分析系統發育有些複雜，因有些時期變化特別快、不同分子和相同分子不同部位會以不同速率改變

系統發育樹Phylogenetic Trees 用分枝圖或樹的形式說明，一個系統發育樹是由連接節的分支所組成的圖 節代表分類單位，如種或基因; 外的節，位於分支的末端，代表活的生物 樹可以有一個時間尺，或分支的長度可以代表發生在兩個節之間的分子改變的數目 樹可以是無根或有根 無根樹僅表示系統發育關係，不提供演化途徑 有根的樹提供一個節作為那個共同祖先 序列間差異的程度以演化距離(evolutionary distance)表示之

rRNA、DNA和蛋白質作為系統發育之指標物 rRNA, DNA and Proteins as Indicators of Phylogeny 兩種生物之Sab值(S, similarity相似程度)愈高，生物間親緣關係就愈近 Sab值可測量演化時間 一群很早就分叉的原核生物，其Sab值將會在一個大範圍內，某類原核生物的Sab值範圍愈窄，那麼它就愈現代 16S rRNA有一 個或多個被稱為寡核苷酸標籤特徵核苷酸序列。寡核苷酸標籤序列(oligonucleotide signature sequance) 特殊的寡核苷酸序列，大多數或全部之一個特定系統發育類群都有此序列，其他類群很少或從不存在這個標籤序列

各種不同的種和屬分類時， 以DNA相似性研究為主較好 用G+C含量或雜交研究進行比較 直接測序比較或分析DNA限制酶片斷多型性restriction fragment length polymorphism (RFLP) DNA比較是根據完整基因體，非一部分 以70%親緣關係之標準精確定義一個種更加容易 比較許多不同基因體和蛋白質顯示標籤序列存於 基因而非其編碼核糖體RNA

蛋白質序列製作系統發育樹優點 20種胺基酸 構成之系列比由4種核苷酸構成的序列在每個點上有更多信息 蛋白質序列比DNA和RNA序列較少受物 種特異之G+C含量差異的影響 蛋白質序列排列較容易，因它不像rRNA序列那樣視二級結構而定 不是所有蛋白質都適合於研究發生在長時期 大尺度的改變 組蛋白和熱激蛋白質不會快速變化 免疫球蛋白變化相當迅速

多相分類學Polyphasic Taxonomy 系統發育結果隨著分析數據變化而變化 分類學家認為所有可能正確的數據都應該被用於測 定系統發育 利用一系列表型和基因型的信息當分類依據 從分子性質到生態特徵 血清學技術可以用於鑑定菌株，而非屬或種 蛋白質電泳模型對決定種很有用，但不能區分屬或科 DNA雜交及G+C含量分析可以用於研究種和屬 化學組成、DNA探針結果、rRNA序列、和DNA 序列能用於定義種、屬和科 多性質可得到更穩定和更可靠的結果

生命的主要劃分 THE MAJOR DIVISIONS OF LIFE 大多數微生物學家現在相信生命能分成三個明顯的不同類群 域Domains Carl Woese等人，使用rRNA研究將生物分成三個域(domains) :古生菌、細菌和真核生 物 兩個極為不同的原核生物類群：細菌和古 生菌，原核生物中細菌佔了大部分 其他的系統發育樹 6個或更多與主要域相關聯不同的樹 許多因子影響到演化樹的繪製，僅用少數分子的序列會得到不精確的通用樹

3個類群之間是等距，與早期rRNA 數據相符 菌和真核生物有共同祖先。細菌可能比其他的域先存在 中古生 依賴硫、極端嗜熱原核生物稱為原生細胞，是一個分開類群，與真核生物的關係比古生菌親緣關係近 真核細胞是嵌合的，由一個細菌和一個古生菌融合生成（可能是缺少細胞壁的一個細菌吞食了一個古生菌

細菌、古細菌與真核生物的比較 性質 細菌 古細菌 真核生物 有核仁、核膜的細胞核 無 有 複雜內膜胞器 細胞壁 含胞壁酸的肽聚醣 多種類形，無胞壁酸 無胞壁酸 膜脂 有酯鍵、直鏈脂肪酸 有醚鍵，支鏈脂肪酸 氣囊 tRNA 含有thymine N-甲醯甲硫胺基起始 無thymine 甲硫胺基起始 含有thymine甲硫胺基起始

性質 細菌 古細菌 真核生物 順反mRNA 有 無 mRNA剪切、加帽及poly A tail 核糖體 大小 延長因子2 對氯黴素與卡那黴素敏感 含胞壁酸的肽聚醣 多種類形，無胞壁酸 無胞壁酸 對anosimycin敏感 有酯鍵、直鏈脂肪酸 有醚鍵，支鏈脂肪酸

性質 細菌 古細菌 真核生物 依賴DNA的RNA聚合酶數目 結構 對rifampicin敏感 一個 簡單次單元-4個 敏感 幾個 複雜次單元-8～12個 不敏感 三個 複雜次單元-12～14個 聚合酶II型啟動子 無 有 代謝 相似ATP酶 是 甲烷生成 固氮 以葉綠素行光和作用 化學無機自營

構建滿意的演化樹的最大困難之一為基因廣泛而頻繁發生水平或橫向轉移 真核生物擁有來自細菌和古生菌的基因 兩個原核生物域之間有著頻繁的基因交換 此種基因移動係來自病毒媒介的轉移 因此微生物進化的模型並不像先前認為是線性或樹狀 更實際的網狀樹 域內基因轉移比域間多，這3個域保持獨立分開 常從16S rRNA序列所得的樹，因這些數據極其廣泛，大多數微生物學家採用

界Kingdoms 大多數細菌學家承認為三域系統時，許多原生生物學家、植物學家和動物學家仍認為生物分為5或5 個以上的界 Robert H. Whittake於1960年代提出的五界系統分類 生物依據至少三個主要標準分為五界 細胞類型原核的或真核的 單獨的和群體的單細胞組織或多細胞 營養類型 許多生物學家不接受五界系統理論，主要是古生 物和細菌缺少明確區別 原生生物界也許太多樣性以致於無分類學用處 褐藻可能與植物親緣關係不相近，五界系統將它置於植物界

5界

6界

Cavalier-Smith 8界 採用了超微細結 構特徵和rRNA序列和其他分子數據，分為2個域和8個界 Archezoa是原始真核單細胞生物 著色生物界 (Chromista)包括主要的光合作用生物 Cavalier-Smith 8界

Sogin和他的合作者沒有將真核生物分成幾個主要部分，而認為它們是一個單獨的域，由獨立進化世系集合組成 古生菌 古始動物菌

伯杰氏系統細菌學手冊 BERGEY'S MANUAL OF SYSTEMATIC BACTERIOLOGY 1923年，賓西凡尼亞大學細菌學教授David Bergey和四位同事出版能鑑定細菌種的細菌分類法， 伯杰氏系統細菌學手冊，現在已發行至第九版 伯杰氏系統細菌學手冊第一版 The First Edition of Bergey's Manual of Systematic Bacteriology 4卷33組中，每組包括之原核生物有幾個容易鑑定的共同特性 一般形狀 和形態學、革蘭氏染色性質，氧的關係，運動性，內生孢子的存在，產能方式等等

分成4卷 (1)普通、醫學或工業有用的革蘭氏陰性細菌 (2)除放線菌外的革蘭氏陽性細菌 (3)具顯著特性的革蘭氏陽性細菌、藍細菌和古生菌 (4)放線菌(革蘭氏陽性絲狀細菌) 表型性分類中，以革蘭氏染色性質分在哪一卷

伯杰氏系統細菌學手冊第二版 The Second Edition of Bergey's Manual of Systematic Bacteriology 見附錄III 自從1984年，第一版出版以來，原核生物分類學已經有很大的進展 特別是 rRNA、DNA和蛋白質定序使原核生物的系統發育分析成為可行 大幅依據系統發育，而非表型性特徵，因此與第一版相當大的差異 第1卷 古生菌、深分支和光合細菌，2001年出版 第2卷 變形桿菌，2003年出 版 第3卷 低G+C含量革蘭氏陽性菌 第4卷高G+C含量革蘭氏陽性菌 第5卷一泛徽狀菌、螺旋體、絲桿菌、擬桿菌和 梭桿菌(第5卷也將包含自第1卷出版後已被修訂之 描述和系統發育排列)