How DNA Sequence Is Determined? DNA fragments having a difference of one nucleotide can be separated on gel electrophoresis Polyacrylamide Gel Electrophoresis T A G C ATCGATCGAT 32P ATCGATCGA 32P ATCGATCG 32P ATCGATC 32P ATCGAT 32P ATCGA 32P G ATCG 32P C ATC 32P T AT 32P A A 32P 核酸 定序方法的精髓，在於如何製得一系列的核酸片段，而這些片段各中止於不同的鹼基位置，一個鹼基的差異即可用電泳分析出來 (上圖左)；另外，要把尾端鹼基相同的片段提出來，放在一起進行電泳，比較這樣的四條電泳圖譜，即可推出序列。上圖說明這些定序方法的原理，有兩種方法可製備一系列長度不同的核酸片段，請見下一頁。 目前大多定序工作已經自動化，並且利用新的螢光標示物質，以及靈敏螢光檢測器，可以直接辨認鹼基的種類；另外，也改用毛細管電泳或 HPLC 進行核酸片的分離，使得定序的進行更為快速而精確。 But these bands can’t tell us the identity of the terminal nucleotides If those band with the same terminal nucleotide can be grouped, then it is possible to read the whole sequence Juang RH (2004) BCbasics
How to Obtain DNA Fragments Maxam-Gilbert's Method: Chemical method Destroy → Cleavage 32P ATCGATCG AT 32P ATCGATCGAT 32P ATCG ATCGAT Destroy → Cleavage Non-radioactive (invisible) Specific Reaction to G Sanger's Method: 32P Biosynthetic method Keep on going ATCGA 32P A,T,C,G A Analogue TAGCTAGCTA ATCG Producing various fragments or TAGCTAGCTA (1) Maxam-Gilbert 法： 以四種化學反應分別對四種鹼基作用，每一反應只對單一種鹼基進行修飾，而在該鹼基的地方斷開，得到一系列長度不同的核酸片段。 電泳可依照這些 DNA 片段的大小，在膠體中排開，即可依序判讀 DNA 分子上核苷酸的序列；比較如此四組鹼基序列電泳，即可組合成整段 DNA。 (2) Sanger 法： 以樣本 DNA 為模板，使用 DNA polymerase 進行試管中 DNA 生合成。 四個反應中，每個反應各缺單一種核苷酸，而代以其 類似物 (analogue)，則部分合成反應會停在該類似物的核苷酸處，造成各種長短不一的 DNA 片段，以電泳分離如上，即可組合判讀 DNA 的序列。 上述兩種方法，均以 32P 標示在核酸分子上，以便顯像各不同長度的核酸片段。 STOP Terminated Template ATCG A TAGCTAGCTA Juang RH (2004) BCbasics
1 A 2 5’ 3’ 5’ 3’ Sanger’s Method: How Terminated OH PO4 H 5’ P R ddNTP Terminated Normal Linking 3 4 5 6 A PO4 2- H 3’ 5’ 2 Phosphodiester bond 目前 都用 Sanger 的生合成法，以目標核酸為模板，加入四種核苷酸及 polymerase，複製該段核酸；但除了所加的四種核苷酸外，額外加入其中任一種核苷酸的雙去氧衍生物 dideoxynucleotide，則合成反應將可能止於這種核苷酸的位置上，因而可得到各種長短不同的片段，以電泳可以依序排列出來。 3’ dideoxynuceotide Can not react Juang RH (2004) BCbasics