分子实验基本操作培训 余涛,郑勤思 2008-4-13.

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分子实验基本操作培训 余涛,郑勤思 2008-4-13

Outline 分子实验基本流程介绍 分子实验基本操作的原理、步骤及注意事项 总结

分子实验基本流程介绍 大肠杆菌的培养 转化 感受态的制备 小提质粒并酶切鉴定(电泳) PCR克隆目的片断 酶切及酶切片断回收(电泳) 连接

分子实验基本流程介绍 大肠杆菌的培养 转化 感受态的制备 小提质粒并酶切鉴定(电泳) PCR克隆目的片断 酶切及酶切片断回收(电泳) 连接

分子实验基本操作——大肠杆菌的培养 原理 大肠杆菌在37 ℃下在较好较快的进行增殖, 4 ℃下则可较好停止代谢,便于保存。(长期保存应在-80 ℃ 用15-20%甘油冻存) 由于转入的质粒带有抗性标记,用带有抗生素的培养基即可进行选择性培养。 分为固体培养基培养和液体培养基培养

分子实验基本操作——大肠杆菌的培养 Step0: LB培养基的配制(1L培养基含) 10g Tryptone 5g Yeast Extract 10g NaCl 15g Agar (仅在固体培养基中加入,注意琼脂为Agar琼脂糖/Agarose区分) 1L 去离子水 一般一瓶配100-300mL Step0’: 灭菌(此后一切保持无菌操作)

分子实验基本操作——大肠杆菌的培养 固体培养基培养 (用于筛选或短期保存菌种) Step1: 倒板 微波炉加热培养基 -> 室温冷却至60 ℃左右 -> 移入超净台,加入抗生素(1000*的,即需稀释1000倍),摇匀 -> 趁热快速倒入平板,12mL/板 -> 超净台内室温冷却凝固 Step2: 接种 划线法:烧红接种环 -> 冷却 -> 蘸上菌液 -> 在平板上划线 ->灼烧接种环。 多用于菌种保存 平铺法:用玻璃刮刀将菌液铺干与平板上,多用于转化

分子实验基本操作——大肠杆菌的培养 固体培养基培养 Step3:37℃培养箱中培养。注意需要先正置10min(防菌液倒流)再倒置培养(防止染杂菌)。注意培养时间不可过长,一般不超过16小时,防止突变株产生。 Step4:培养结束后,需放入4 ℃冰箱的,为防止染杂菌,最好用parafilm封口。

分子实验基本操作——大肠杆菌的培养 液体培养基培养(用于扩增) Step1:取出适量培养液于锥形瓶或试管。 Step2: 加入适量抗生素。 Step4: 将培养液放入37 ℃摇床中培养,转速一般为220rpm。(为什么要摇?)

分子实验基本操作——大肠杆菌的培养 注意事项: 无菌操作!!! 抗生素加入的时机及量 培养时间(不可过长) 返回

分子实验基本操作——感受态的制备 原理: 感受态 - 可接受外来DNA的状态 CaCl2法制备 – Ca2+可以使膜骨架发生改变,产生膜 上的小孔洞,并可使DNA分子结合并进入细胞内。 步骤:比较麻烦,属较考验分子操作的实验之一。往往大批量制备,因此不需经常进行。 注意事项:感受态制备后应立即冻存于-80℃。使用时不可反复冻融。 返回

分子实验基本操作——酶切及酶切片断回收 原理: 限制性内切酶: 1)发现于细菌中,用于降解噬菌体的DNA;宿主自身的DNA则被甲基化。 2)分为I、II、III类。常用II类(识别位点与酶切位点一致) 3)区别与外切酶活性(内切酶彻底切断DNA双链,外切酶只切其中一链,往往用于DNA复制的实时检验。) 分类:单切和双切

分子实验基本操作——酶切及酶切片断回收 单切: Step1: 酶切体系的选定 确定选用的酶 -> 查找对应高效率的buffer(常用的buffer有H, M, L, K, T 五种),确定要不要加BSA H, M, L, K, T buffer 都有什么? H-High, M-Medium, L-Low, K-KCl, T-Tri-Acetate B-L, G-M, O-H, R-K, Tango-T

分子实验基本操作——酶切及酶切片断回收 Step2: 配制酶切体系: 以10uL体系为例 0.5uL 内切酶(含50%甘油防冻) 1uL Buffer (10*) 5uL 质粒 3.5uL 去离子水 原则: 1) 甘油含量不可超过总体系5%,防止星火性 2) 质粒可根据具体情况调整 3) 内切酶切记不可置于常温!!

分子实验基本操作——酶切及酶切片断回收 Step3: 置于37℃培养箱中,温育2-4h。(用水浴也可以,但可能会使溶液因蒸发而产生浓度不均匀)。注意有些特殊的酶所需的条件有所不同,主要是温度条件。 Step4: 纯化,方法同PCR片段纯化。 Step5: 电泳检测

分子实验基本操作——酶切及酶切片断回收 双切: Step1: 酶切体系的选定 确定选用的两种酶 -> 查找对应双切的Buffer,同时看与分别单切的高效buffer是否吻合 -> 确定要不要加BSA Step2: 配制酶切体系。与单切类似,但需要注意酶的用量。(甘油含量不可超5%.) Step3: 37℃温育2-4h Step4: 凝胶回收

分子实验基本操作——酶切及酶切片断回收 凝胶回收:即双切后将所需要的小片段重新富集纯化。 Step1: 电泳,电泳过程中称重一小离心管。 Step4: 关闭紫外,称重,根据kit protocol进行余下试验。 返回