4 純化策略 Purification strategy 1 4 純化策略 Purification strategy 4.1 純化步驟設計 Design a purification protocol 一邊進行純化工作，一邊改進純化方法或步驟 摸著石頭過河 (Trial and error) 4.1.1 影響純化的因素 Critical factors in purification 高活性、高回收率、高純度、方便快速、經濟 4.1.2 組合純化步驟 Set up purification steps 組合各種方法以達純化效率 4.2 純化結果 以純化表來檢討整体純化效果 Purification table summarized the final results 說明文字

Recovery 4.1.1 檢討純化效果 Critical factors ● 高活性 Resolution ● 高回收率 ● 高純度 2 4.1.1 檢討純化效果 Critical factors 純化效果？ ● 高活性 High activity ● 高回收率 High recovery ● 高純度 High purity ● 方便與快速 Rapid ● 經濟 Economy Resolution Capacity Speed 樣本容量？ 說明文字 操作速度？ Recovery 蛋白質及活性回收？

Amino acid, monosaccharide, nucleotide, fatty acid 3 ■ 純化或分析方法原理 1 2 3 4 Chapters Cell Organelle isolation? 胞 器 Cell homogenization Macro molecules 細胞 碎片 Cell debris Small molecules Amino acid, monosaccharide, nucleotide, fatty acid Protein Nucleic acid Polysaccharides Ammonium sulfate precipitation 硫酸銨沈澱法 Molecular size Molecular charge Molecular polarity Affinity Ion exchange, Chromatofocusing, Disc-PAGE, Isoelectric focusing Reverse phase chromatography, HIC, Salting-out Gel filtration, SDS-PAGE, Ultrafiltration Affinity chromatography, Hydroxyapatite 各種純化方法所依據的蛋白質特性不同： 酵素研究大多要先把該酵素純化出來，才能夠做進一步的分析與鑑定。酵素來源通常由細胞取得，在打破細胞後離心除去細胞碎片。所得到的巨分子中，有核酸、蛋白質、多糖類與脂質的聚合物 (脂質不是巨分子)，再來可以用硫酸銨把所有蛋白質沈澱下來，酵素即包含在其中。接著，我們可以利用各種酵素分子間的性質差異，來做進一步的純化；例如，分子量不同的酵素，可以利用膠体過濾法 (gel filtration) 來分離。以上各種蛋白質的性質差異，可以用不同的組合方式，來分離純化蛋白質，一直到接近純質為止。請注意，一般都是以水溶性蛋白質為對象，若是脂溶性的疏水蛋白質，則整個系統就要加入界面活性劑助溶，各種操作方法都會稍有改變。 Useful basic protein properties in planning isolation steps

Sedimentation at various density 4 ■ 如 何 分 離 這 些 大 小 物 件 shape size density 1 3 4 6 7 8 9 10 11 12 2 5 wood stone cotton wood wood cotton stone wood stone cotton stone cotton Size 1 2 3 Shape 4 5 8 6 cotton wood stone 4 8 5 4 6 7 8 5 Density 像玩具總動員一樣來玩純化的遊戲： 要純化或分離出某種蛋白質，就要利用蛋白質之間某些 性質上的差異，例如它們的形狀、大小、比重等不同。 如上圖的假想例中有 12 個物件，其大小、形狀與比重都不完全相同。若我們要分離出其中的 5 號木球，首先用一大一小兩種篩子，就可去掉 1, 2, 3 號三個較大者，以及 9, 10, 11, 12 號四個較小者。剩下的 4 - 8 號都有相同的大小，但因比重不同，在一個裝有密度梯度溶液 (如甘油梯度) 的量筒中，7 號石頭塊很塊下沈，六號棉球又無法下沈，我們因此可以在中央部份收到木質的 4, 5, 8 號物件。然後把這最後的三個物件放在一斜坡上滾下來，5 號木球會因為形狀的關係滾得最快，而 4 號因為是方塊而幾乎不動，8 號則介於兩者之間慢慢滾下來。我們因此可以分離得到 5 號木球，同時也可分得 4 號及 8 號。 在實際生活裡，我們當然不會用如此笨拙的方法來分離這些東西，但其基本原理與蛋白質的分離與純化非常類似；我們的確利用蛋白質間分子量、分子形狀及密度的不同，或者分子所帶電荷不同，來作酵素的純化分離工作。 7 9 10 11 12 Sieving different sizes Sedimentation at various density Rolling down in Different speed How to separate these 12 objects?

4.1.2 組合純化步驟 Set up your purification protocol 5 4.1.2 組合純化步驟 Set up your purification protocol 硫酸銨分劃 Ammonium sulfate fractionation 分子表面極性不同 The polarity of proteins 純 化 流 程 基 本 骨 幹 離子交換法 Ion exchange 分子淨電荷不同 The charge of proteins 膠体過濾法 Gel filtration 分子量大小不同 The molecular size of proteins Basic backbone for purification 說明文字 HIC? Hydroxyapatite? Affinity chromatography? Another ion exchange?

■ 純 化 過 程 的 鳥 瞰 Ion exchange pI 7 5 6 4 kD 100 50 25 Gel filtration 6 說明文字 這個類比 不很精確 The outcome of the purification after two chromatographic steps

4.2 Sucrose synthase 純化表 Purification table 7 4.2 Sucrose synthase 純化表 Purification table From 100 g rice grain at its milky stage (乳熟期) Purification Steps ↓ Total protein (mg) Total activity (Unit) Specific activity (Unit/mg) Purification fold (fold) Recovery (%) Crude extraction 1,070 9,672 9.0 1.0 100 Protamine sulfate precipitation 800 12,555 15.7 1.7 130 Ammonium sulfate (35-55% sat) 250 6,610 26.4 2.9 68 Sepharose CL-6B gel filtration 53 5,789 111.3 12.4 60 DEAE Sepharose ion exchange 8.6 2,960 344.2 38.2 31 1,070 9,672 800 12,555 250 6,610 53 5,789 8.6 2,960 9.0 15.7 26.4 111.3 344.2 1.0 1.7 2.9 12.4 38.2 100 130 68 60 31 說明文字 (a) 比活性 (b) 純化倍率 (c) 回收率 (b) (c) (a) 表 4.1

酵素純化方法 Enzyme Purification (EP) 0 酵素實驗室 Enzyme Laboratory 1 蛋白質抽取 Protein Extraction 2 色層分析法 Chromatography 3 其它純化方法 Other Methods 4 純化策略 Purification Strategy ●第〇章實驗室的軟硬兩件大事 ●後面四章由最初抽取開始，進入各種純化方法及策略 ●所有方法都是根據最基本的生物化學特性 (因此你的普化、有機、生化基礎很重要！)