实验四 间充质干细胞的培养及鉴定

一、实验目的 1、 掌握大鼠骨髓间充质干细胞原代培养的方法。 2、 熟练掌握间充质干细胞的传代、冻存和复苏的操作过程。 1、  掌握大鼠骨髓间充质干细胞原代培养的方法。 2、  熟练掌握间充质干细胞的传代、冻存和复苏的操作过程。 3、  掌握间充质干细胞表面抗原的鉴定方法。 4、通过诱导间充质干细胞成脂、成骨分化，鉴定间充质干细胞的多向分化潜能，并掌握其诱导分化的方法。

二、实验材料、试剂与器材 1 材料：100-150 g SD大鼠。 2 试剂：乙醚，75%酒精，L-DMEM 低糖培养基，胎牛血清，小牛血清，Percoll细胞分离液，1.5M NaCl溶液，0.25%胰酶，FITC标记的羊抗鼠CD29抗体，FITC标记的羊抗鼠CD90抗体，FITC标记的羊抗鼠CD71抗体，PE标记的羊抗鼠CD106抗体，FITC标记的羊抗CD45抗体，β-甘油磷酸钠，地塞米松，维生素C，Hoechst33258，油红O，20 g/ L硝酸钴溶液，20 g/L硫化铵，50%甘油，多聚赖氨酸（PLL）。 3 仪器： 细胞培养箱，微量移液器，倒置相差显微镜，细胞培养皿，荧光显微镜，电子天平，pH计，离心机，超净工作台，电热恒温鼓风干燥箱，电热恒温水槽，超声波清洗机，立式压力蒸汽灭菌器。

三、实验原理 间充质干细胞最早发现于骨髓中，其具有高度增殖和自我更新能力，但骨髓中MSCs的含量很低，约为0.01%。分离间充质干细胞的方法主要有三种：①全骨髓贴壁培养法；②密度梯度离心法；③根据间充质干细胞的表面标志，利用流式细胞仪进行分选。在本实验中所用的是密度梯度离心法，即利用Percoll将大部分造血细胞和单个核细胞分离、经过体外贴壁培养换液去除悬浮生长的造血干细胞、分离获得MSC的纯度达到90%左右。 间充质干细胞没有特异性表面抗原，表达CD29、CD44、CD71、CD90等基质细胞和间质细胞的特异性表面标志抗原。本实验选择了CD29、CD44、CD90、CD71、CD106和CD45进行检测。

间充质干细胞连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化能力，而且可保持正常的核型和端粒酶活性，但并不能自发分化，在体外特定条件下可分化为成骨细胞、软骨细胞，脂肪细胞等多种中胚层来源的细胞，不仅如此，它还可跨胚层分化为神经元细胞，胰岛细胞等。

（一）骨髓间充质干细胞的原代培养 1.取体重100-150 g的大鼠，乙醚麻醉，颈椎脱臼处死，75% 的酒精浸泡消毒5 min。 2.将大鼠腹部朝上，四肢用注射器针头固定于泡沫板，呈“大”字形，用剪刀，镊子将两后肢皮肤剪开，换另一套剪刀、镊子分离肌肉、肌腱，将股骨、胫骨剥离出来，放入装有75% 酒精的烧杯中，移入超净台。 3.将胫骨、股骨取出放入培养皿中加入10 ml PBS缓冲液，用洁净的剪刀、镊子进一步剥离骨头上的肌肉、肌腱组织。 4.将剥离干净的骨头用少量PBS冲洗后，放入另一培养皿，加入12 ml DMEM完全培养基，在培养基中剪断骨干两端，用2 ml注射器吸取培养基插入一头断端将骨髓从另一头冲出，反复吹打使骨髓分散，制成均匀的细胞悬液。

5.另取一干净离心管A，加入10 ml Percoll分离液。将吹打均匀的细胞悬液沿倾斜30o缓缓加入，切记不能冲破Percoll分离液面，用8 ml DMEM完全培养基冲洗培养皿，后用同样的方法将其加入离心管A。 6.2500~3000 r/min，离心30 min后，可见离心管A中液体基本分三层，用吸管吸去上层红色培养基层，将吸管伸至中间白色絮状层将其缓慢吸出，移至另一干净离心管B，切记吸取时不可用力过猛而将沉于管底的红细胞吸上来。 7.将20 ml PBS加入离心管B，反复吹打混匀，1800 r/min离心10 min。 8.弃上清，重复步骤7。 9.弃上清，加入5 ml完全培养基，吹打混匀，接种于培养瓶中。

【实验结果与分析】 每天注意观察培养的原代细胞的形态，并拍照记录。

【思考题 】 1、密度梯度离心法的原理是什么？ 2、间充质干细胞的原代培养过程是什么，有哪些方面是需要注意的？

(二) 间充质干细胞的传代、冻存及复苏 1.当细胞融合度达到90%左右时，将培养液吸出，加入PBS冲洗细胞两次。 2.加入0.25%的胰酶2 ml，置于37℃培养箱中2~3 min，取出在显微镜下观察，当80~90%的细胞回缩成圆形，振摇后脱离瓶底时，移入超净台。 3.传代：加入3 ml DMEM完全培养基终止消化，用吸管反复吹打瓶底，将细胞悬液移入离心管中，1200 r/min，离心10 min。弃上清，加入10 ml培养基吹打混匀。接种于两个培养瓶中。 4.冻存：加入3 ml DMEM完全培养基终止消化，用吸管反复吹打瓶底，将细胞悬液移入离心管中，1200 r/min，离心10 min。弃上清，加入1 ml冻存液（FCS ：DMSO：L-DMEM=2：1：7）吹打混匀，置于冻存管中，4℃放置 30~40 min，-20℃ 放置1 h，-80℃过夜，再移入液氮罐中。

1. 复苏： 1)将细胞从液氮中取出，37 ℃轻微摇晃，使细胞快速融化。 2)75％酒精擦拭冻存管，将细胞转移到离心管中，加入5 ml培养基，1000 r/min 离心5 min。 3）弃上清，加入5 ml完全培养基混匀细胞，接种于25 cm2培养瓶中。

【实验结果与分析】 试述细胞传代培养的、冻存及复苏的过程，以及各环节的注意事项。 【思考题 】 1、细胞传代培养的目的是什么？ 2、细胞冻存与复苏的原则是什么，怎么操作？ 冻存液的成分以及作用是什么？

（三 ） BMSCs鉴定 1 BMSCs表面抗原鉴定： 1）22×22 mm盖玻片酸缸浸泡过夜，自来水冲洗10次，三蒸水冲洗3次，浸泡于75%酒精中备用。 2）包被时取出75%酒精中的盖玻片，在酒精灯上烘干，放入35 mm2培养皿中，吸取0.5 ml浓度为50 μg/ml的多聚赖氨酸滴加在盖玻片上，37 ℃放置1 h，回收多余的多聚赖氨酸。经紫外线照射30 min,后在超净工作台内内晾干。

3）将预先经过灭菌处理并包被多聚赖氨酸的盖玻片置于35 mm2培养皿中，将第5代BMSCs用0 3）将预先经过灭菌处理并包被多聚赖氨酸的盖玻片置于35 mm2培养皿中，将第5代BMSCs用0.25%胰酶消化，按1×105/ml密度接种，37℃、5% CO2条件下培养。 4）待细胞70%汇合时细胞去除培养基，进行免疫荧光染色鉴定其表面抗原CD29、CD34、CD45、CD71、CD90、CD106的表达。用PBS清洗，加入4%多聚甲醛固定，4℃过夜。PBS洗3次后，分别滴加用PBS+NaN3(0.02%)+BSA(3%)+ TritonX-100(0.2%) 稀释的单克隆抗体孵育，室温90 min。PBS洗3次。细胞核用Hoechst 33258染色，室温放置5 min并冲洗。用50%甘油缓冲液封片，荧光显微镜观察拍照。

【实验结果与分析】 观察表面抗原的免疫荧光染色结果： 【思考题 】 1、免疫荧光染色的步骤是什么，需要注意什么？ 2、怎样用荧光显微镜拍摄荧光照片？

A. 第五代骨髓间充质干细胞的形态学特征： 长梭形（黑色箭头）和扁平形（红色箭头），Bar= 50 μm

B-H.第五代BMSCs的免疫荧光鉴定结果（蓝色为Hoechst 33258染色，显示细胞核）

2、BMSCs的诱导分化 1)成脂诱导：将骨髓间充质干细胞以4×103/cm2的接种密度培养在35 mm培养皿里，待细胞融合后将含10% NCS的低糖DMEM生长培养液换为成脂肪分化诱导液（高糖DMEM+10%血清+10 μg/ml胰岛素+1 μM地塞米松+100 μM吲哚美辛+0.5 mM 3-isobutyl-1-methylxanthine）培养，每隔3 d换诱导液一次，持续诱导培养6 d。 然后用维持液（高糖DMEM+10%胰岛素）继续培养细胞3 d。各组细胞用PBS冲洗3次，4%多聚甲醛固定10 min，油红O工作液浸染10 min，60%异丙醇洗去多余染液，PBS冲洗3次，苏木精复染3-5 min，PBS漂洗10 min。镜下观察并摄影。

2)成骨诱导：将骨髓间充质干细胞以4×103/cm2的接种密度培养在35 mm培养皿里，12 h后将含10% NCS的低糖DMEM生长培养液换为成骨诱导液培养，每隔3 d换诱导液一次，持续诱导培养30 d后用钙钴染色鉴定成骨细胞。取成骨诱导30 d的BMSCs，弃培养基，PBS洗3次，置95%乙醇固定液中固定10 min凉干。置基质液中，37 ℃孵育4～6 h（防止水分蒸发）。取出放入20 g/L 硝酸钴溶液中5 min，流水冲洗，加入20 g/L 硫化铵（新鲜配制）溶液中作用5 min。流水冲洗，伊红复染5 min，冲洗、晾干镜检。

【实验结果与分析】 A.BMSCs成骨诱导后的钙钴染色结果，Bar= 50 μm；B.BMSCs成脂肪诱导后的油红染色结果，Bar= 50 μm

【思考题 】 1、试述间充质干细胞成脂诱导、成骨诱导的方法。 2、成脂、成骨诱导分化后，怎样进行染色鉴定？