实验三 粗糙链孢霉(Neurospora crassa)的杂交（教材p133-9）

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1 实验三 粗糙链孢霉(Neurospora crassa)的杂交（教材p133-9）
一、实验目的 1.       通过分析粗糙链孢霉杂交后代的表现型，学习掌握顺序四分子遗传分析的基本技术； 2． 掌握着丝粒作图和相关基因定位的原理、技术。

2 二、 实验原理 粗糙链孢霉（Neurospora crassa） 属于真菌中的子囊菌纲 （n=7） 无性生殖:分生孢子 生殖方式 有性生殖:不同接合（交配）型： A,a 或 mt+,mt-

3 有性生殖过程 1.分生孢子落在原子囊果的受精丝上 2.不同接合型的菌丝相接触，两核配对

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7 粗糙链孢霉生活史 ·受精→异核体→合核体 ·减数分裂、有丝分裂→8个核 ·子囊果 子囊 子囊孢子 ·适宜条件（60℃ 1-2h），
1.无性繁殖 2.有性繁殖 ·受精→异核体→合核体 ·减数分裂、有丝分裂→8个核 ·子囊果 子囊 子囊孢子 ·适宜条件（60℃ 1-2h）， 子囊孢子萌发成新的菌 丝体

8 ·链孢霉材料的优点 单倍体 生活周期短（10d左右） 个体小、生长迅速 易于培养（要求条件简单） 一次杂交可获大量后代 染色体结构和功能类似于高等生物 可直接观察减数分裂产物的排列次序

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11 ·着丝粒作图

12 概括来说， 凡是等位基因在减数分裂第一次分裂分离的子囊即为非交换型子囊；凡是等位基因在减数分裂第二次分裂分离的子囊即为交换型子囊。

13 三、 实验用品 1 实验材料： 粗糙链孢霉野生型菌株Lys+（接合型A），分生孢子为橘红色
2 器具： 显微镜（或双目解剖镜）、接种环、载片 等 3 药品和培养基 （1）5%次氯酸钠（或5%石炭酸） （2）完全培养基（马铃薯培养基） (3) 无菌水(各小组自己灭菌—100ml三角瓶)

14 操作前准备（用于链孢霉杂交） 在一个100mL三角瓶中装约50-60mL的蒸馏水 (玉米)杂交培养基准备
每小组适量玉米粒(如3人组:12粒)(已经浸泡软),用镊子等硬器破碎,平均分装于大试管(自己柜子里的)(每人一个管) +0.1g琼脂+10mL蒸馏水,混匀 插入3-4cm折叠多次的滤纸条 加上棉塞(或专用瓶盖) 3. 将上述蒸馏水、培养基进行高压灭菌（培养基灭菌后不摆斜面）

15 四、 方法步骤 (p137-138) 1 菌种活化（教师准备） ：两亲本均在28℃条件下培养5d左 右（完全培养基斜面，可添加赖氨酸 ）
2 杂交（本次操作） ：两亲本的少许菌丝或分生孢子同时接 种于杂交培养基上。 试管上贴上标签，注明杂交日期和实验者姓名。 25℃ ，一周左右有棕色原子囊果 ，2周左右便发 育为成熟子囊果 。 3 观察（两周以后） 培养物处理（少量无菌水冲掉分生孢子，倒三角瓶中煮沸） 载片制作（滴次氯酸钠→覆载片摁压→挤破子囊） 低倍镜观察，记录统计（注意是否出现基因转变）。

16 观察时期要掌握适当 偏早，孢子尚末成熟…白色 过迟，孢子全为黑色…交换型-非交换型分类困难

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19 倒掉

20 注意事项： （1）实验用过的接种针要过火灭菌。 （2）镊子放入次氯酸钠中浸泡五分钟后洗净。 （3）三角瓶中的液体要煮沸五分钟，才能倒掉。 （4）用过的载玻片马上放入石碳酸中浸泡，以杀死子囊孢子，过一段时间后取出、洗净、擦干。

21 五、 练习题(在记录本上做) 请观察一定数量的完整子囊果，并对子囊的类型进行统计，求出Lys基因的着丝粒距离是多少？
利用不同接合型的粗糙链孢霉的杂交实验对孟德尔分离规律进行验证，为什么说比利用二倍体生物来得简单？请简单说明。