PCR 污染的产生及防治 分子生物学技术平台讨论会 ——PCR 系列之一
PCR 污染的监测 PCR 强大扩增能力 + 检测的敏感性 经 30 个周期后，特定 DNA 片段的数量在理论上可增加 10 9 倍 极微量的污染便可导致假阳性，尤其对定量造成很大的问题 NTC (No Template Control): 必须设置一个不含模板 DNA 但含有 PCR 系统中所有其他成分的对照 反应，这一对照管须在准备好所有其他 PCR 以后才进行吸加。
常见的 PCR contamination 常规 PCR 荧光定量 PCR NTC
引起 PCR 污染的原因 模板间交叉污染 容器被污染 模板放置时, 由于密封不严溢于容器外 容器外粘有模板而造成相互间交叉污染 模板吸取过程中, 因气溶胶（ aerosol ）或其他原因引起移液器污 染，从而导致交叉污染
引起 PCR 污染的原因 PCR 试剂污染 PCR 试剂配制过程中, 移液器、容器、水等原因造成试剂被 PCR 核酸模板污染。
引起 PCR 污染的原因 PCR 产物污染 - 最主要最常见 PCR 产物拷贝量大，极微量的 PCR 产物污染, 就可形成假阳性。 移液器吸取 PCR 产物进行电泳检测，同一支移液器去准备 PCR mix PCR 产物的气溶胶污染： 一个气溶胶颗粒可能含几万个拷贝 ※气溶胶（ aerosol ）：悬浮于气体介质中粒径一般为 0.001μm~1000μm 的固体、液体微小粒子形成的胶溶状态 散体系。 空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶, 在操作时比较剧烈 地摇动反应管, 开盖时、吸样时及移液器的反复吸样都可 形成气溶胶
引起 PCR 污染的原因 实验室中克隆质粒的污染 克隆质粒浓度高, 另外在纯化过程中需用较多的用具及试剂, 其污 染可能性也很大
防止 PCR 污染 首要原则 永远要设置 NTC 对照 如果不能在污染出现的第一时间发现，会导致严重的 后果：一大段时间的数据不可信 准备 PCR 的移液器要专用 千万不能用吸取 PCR 产物 / 克隆质粒的移液器去准备 PCR 体系
防止 PCR 污染 空间： 合理分隔实验区域 : 将样品的处理、配制 PCR 反应液、 PCR 循环扩增及 PCR 产物的鉴定等步骤分区进行， 特别注意样本处理及 PCR 产物的鉴定应与其它步骤 严格分开。 理想状态： 各个区域实验用品及移液器专用，实验前应将该区 域用紫外线消毒，破坏残留的 DNA 或 RNA 。
防止 PCR 污染 操作 一旦进入吸加 PCR 试剂的专用场所并开始工作，就应戴上一副新手套， 并应勤于更换。 准备专供自己使用的 PCR 试剂，分装为小份。不要与样品存放在一起。 选择质量好的 Eppendorf 管 -- 密封性好且开管不需要太大力气 打开离心管前应先离心，将管壁及管盖上的液体甩至管底部。开管动作 要轻，以防管内液体溅出。 实验结束后及时清理台面
防止 PCR 污染 移液器操作 由于操作时不慎将模板吸入枪内 或粘上枪头是一个严重的污染源， 因而加样时要十分小心。 1 ）准备 PCR 的移液器专用 2 ）吸样要慢，吸样时尽量一次性 完成，忌多次抽吸，切勿形成喷 雾，以免交叉污染或产生气溶胶 污染。 3 ）最好在加完所有其他反应成分 后才吸加模板。 4 ）推荐在准备 PCR 过程中使用滤 芯枪头
选用含 UNG （尿嘧 啶 DNA 糖基酶 Uracil-N- Glycosylase) 的试剂， 有助于防止 PCR 产 物引起的污染。 UNG ： 50 摄氏度， 2 分 钟，作用于含有 dU 的 DNA 双链或单链 然后开始 PCR 反应的预 变性步骤，同时 UNG 失活 防止 PCR 污染 ※对于不含 dU 的 PCR 产物无效
出现污染后解决办法 更换试剂 更换新的试剂和水，用确保无污染的移液器分装备用 清洁所有可能的污染源：实验台面、小离心机、冰箱门把手等等 1 ）实验台面、超净工作台用现配的 3% 双氧水或 10% 次氯酸钠 溶液擦拭清洁。 2 ）或者用 10% 漂白粉溶液擦拭 3) 紫外光照射，照射距离应不超过 90 cm ，照射时间最好过夜。 实验过程中更加小心，采用前面提到的各种防止污染的办法
参考文献 Kwok S,Higuchi R. Avoiding false positives with PCR[J ]. Nature,1989,339 (6221) : Mifflin T.E. Setting Up a PCR Laboratory. CSH Protocols; 2007; doi: /pdb.top14
讨论 设置 -RT 对照后是不是可以不用设 NTC 了？ 使用了滤芯枪头，是否不需要移液器专用了？ ……