组会汇报 多杀菌素高产菌株发酵方面 研究现状 汇报人：王美玲 指导导师：卢文玉 -

多杀菌素的理化性质 刺糖多孢菌的诱变 发酵工艺优化 分批发酵动力学研究

多杀菌素类化合物是由刺糖多孢菌经有氧发酵 后的次级代谢产物。本质上属大环内酯类化合 物，且没有抑菌活性。纯多杀菌素包含 6 种成 分，其中组分 A 和 D 的活性最高。 刺糖多孢菌的培养温度约为 ℃，而产 素的最适温度为 ℃。大规模发酵时应通 过通气量和搅拌速度来维持罐内溶解氧在 60 ％ 以上，最好为 65 ％以上。罐内压力为 0.034Mpa

复壮 单孢子悬 液 诱变 / 抗 性物质 单菌落 筛选 初筛 复筛 测定稳定 性、菌态、 性状 高产 菌株 发酵条件优化 培养基优化

1 、诱变突变株： 菌丝诱变、萌发孢子诱变： 单一诱变和复合诱变 2 、抗性突变株： 多杀菌素抗性突变株：（双层培养法筛选） 鼠李糖（初级代谢终产物、前体 ） 3 、耐代谢产物结构类似物突变株： 庆大霉素、红霉素、安普霉素 4 、诱变和抗性结合（多重迭代） 5 、耐 C 源分解代谢物阻遏突变 2- 脱氧 -D- 葡萄糖 6 、原生质体融合技术

诱变剂 无论化学诱变剂还是物理诱变剂，单独使用很少能收 到预期的效果。所以生产中多采用几种诱变剂复合处 理、交叉使用的方法 UV 和氯化锂 (LiCl) 复合诱变，硫酸二乙酯 ( D E S ) 诱 变，亚硝基胍（ N T G ） 诱变， D E S 和 LiCl 复合诱 变， 60 Co g 及 137 Cs g 诱变 、微波诱变、ＭＮＮＧ LiCl 本身无诱变作用

原生质体制备条件和再生研究 （ 1 ）菌丝生长曲线（对数中期） （ 2 ） Gly 对再生的影响（干扰细胞壁的形成） （ 3 ）溶菌酶、蜗牛酶、纤维素酶浓度、作用时间、 温度的影响（渗透压、稳定剂， Nacl 、蔗糖） （ 4 ）原生质体的灭活（热、紫外） （ 5 ）融合： （种间和种内，与红色糖多孢菌？）（不同分子量和 浓度 PEG 、电融合） （ 6 ）再生培养基的选择（琼脂浓度）

培养基的优化 （发酵和种子培养基） （ 1 ）单一 C （ N ）源、复合 C （ N ）源、有（无）机 氮源、微量元素、均与设计实验、正交试验 （ 2 ）响应曲面法 单因素试验 P-B 试验 SAS 软件分析 显著因素 中 心组合设计 响应面回归分析 三维图 最优方案 （ 3 ）研究 C/N 比对菌丝形态和产量的影响（红霉素） （ 4 ）搜集剂（磷钙、沸石）对产量和 PH 影响 （铵离子）

发酵条件优化 1 、种子液的影响 接种量、种龄 2 、摇瓶发酵条件的优化 发酵周期的确定 消前 pH 、摇瓶转速以及摇瓶装量进行正交设计实验 变温（ 4/5d ）对产素的影响 ( 不 ) 加玻璃珠对生物量和产量的影响 3 、初始浓度葡萄糖、磷酸盐对菌体和产量的影响，磷酸盐对葡萄 糖的利用的影响 葡萄糖效应：补糖时间的确定（流加） 4 、补加前体物质的影响：加入时间和量

5 、接种方式的影响：种子（挖块、菌丝、孢 子）、发酵（一级和二级种子）（阿维霉素） 6 、短链脂肪酸（乙酸、丙酸等）作为缓效碳 源加入时间的确定及影响 7 、 DO 、 OUR 、 CER 、 RQ 的相关分析 8 、硝酸铵 （促进生长，降低产量）、 磷酸二氢钾（ 调节 PH ， ATP 、磷酸酶） 、正丙醇的影响 9 、混合脂肪酸代替豆油 （螺旋霉素） 10 、流加补料的时间、速率， 分批补料

初筛 ( 菌块 —TLC 法 ) 步骤：涂布 培养 浸提 点样 层析 显色 比较 （ 1 、原理：斑点的有无和深浅 （ 2 、验证颜色的深浅与浓度相关（即可行性） （ 3 、展开剂的选择（甲醇 / 丙酮） （ 4 、检测最低浓度、检测范围的确定 （ 5 、琼脂块的大小的确定 设想：如果培养基中含有在含脂肪，以中性红为检测剂， 测定脂肪酶的活性（产量和颜色成正比）

复筛 (HPLC 法 ) 发酵液的预处理：（油的多少） 发酵液 离心 弃上清 浸提 离心 微孔滤膜过滤 HPLC 根据分离度、拖尾因子确定：流动相、流速、进液量， 检测波长。

前体的推测研究 根据大环内酯类青霉素为例：（聚酮反应） 分支氨基酸和植物油分解产生短链脂肪酸 （ 1 ） Asp 、 Gly 、 Met 、 Leu 、 Val 是丙酰 CoA 的来源。 异丁酸、丙酸、乙醇、甲醇、异丙醇、正丙醇、乙酸 铵、丙酸钠、丁酸钠、柠檬酸钠形成乙酰 CoA 、甲基 丙二酰 CoA 、丙酰 CoA 等前体 （ 2 ）最佳前体不同浓度和补加时间、补加方式的影 响

提取条件的优化： 单一溶媒（甲醇、丙酮、乙腈等） 混合溶媒提取（乙酸乙酯的作用） 提取时间 提取方法（超声波、静置） 萃取次数 被提物的选择取（发酵液、菌体）

高产菌株生理特性的描述 菌落形态、菌丝形态、遗传稳定性、 生化特性： 生物量的测定：干重法，测核酸 还原糖的测定： DNS 法 可溶性氨基氮的测定：甲醛法 / 纳氏试剂分光光度法 磷酸盐的测定：氯化亚锡分光光度法 酸价的测定：游离脂肪酸的含量 效价、ＰＨ及其他系数的测定 成分Ａ、Ｄ比重

植物油在大环内酯类抗生素中应用 （ 1 ）疏水性作为缓效碳源避免葡萄糖效应 （ 2 ）为短链脂肪酸的来源，为聚酮类提供前体 （ 3 ）分解为脂肪酸和甘油分别经 β- 氧化， EMP 途径 合成乙酰辅酶 A （ 4 ）消泡剂 （ 5 ）避免使用黄豆饼粉，粘度大，产泡多 （ 6 ）过量产生脂肪酸使 PH 下降 （ 7 ）磷酸镁的影响？ （ 8 ）稳定剂对油的利用 （ 9 ）甲基丙二酰 CoA 羧基转移酶、柠檬酸脱氢酶、 脂肪酶活性大小 （ 10 ）脂肪酸种类、饱和程度、添加量和时间的影响

分批发酵动力学 测定生物量、培养液 PH 、葡萄糖消长、效价 的变化趋势利用 MATLAB 软件对实验数据进行 非线性拟合出细胞动力学模型、基质消耗动力 学模型、产物生成动力学模型.