复习内容 食品菌相 天然食品中常检出AFTB1、AFTB2、AFTG1、AFTG2、FATM1。从结构上分B族、G族。毒性与危害。 酶联免疫吸附测定原理

课后复习 食品菌相 天然食品中常检出AFTB1、AFTB2、AFTG1、AFTG2、FATM1，按照结构分为B族、G族；毒性。 酶联免疫吸附测定原理

第三节 赭曲霉毒素A的检验 3.1 概述 3.2 薄层色谱法

3.1 概述 理化性质：赭曲霉毒素（ochratoxin）是由曲霉菌和青霉属的几个种属产生的有毒代谢产物。基本结构是异香豆素连接到β-苯丙氨酸上的衍生物，有A、B、C、D四种化合物。其中赭曲霉毒素A （OTA）最重要。 OTB没有氯元素，OTC是A的乙酯，OTD是4-羟基A。 OTA酸性条件下溶于苯、三氯甲烷和稀碳酸氢钠溶液，加碱成盐，其盐溶于水。 主要来源：寒冷条件下由纯绿青霉产生，温暖气候下由赭曲霉产生。谷物、大豆和香辛料，特别是红辣椒易受污染。动物饲料优甚。

与人体健康关系：存在于动物的肾、肝、肌肉和血液中，猪是最敏感的动物，肾是主要靶器官。1956年巴尔干地方性肾病。特定的癌症基因变异，p53 「龙胆泻肝汤（丸）」，原药方以木通入药，至1983年因木通资源短缺，中国大陆地方标准便以关木通代替木通。关木通是马兜铃科草药，含马兜铃酸，2003年底 。 卫生标准：食品中没有限量标准。 分析方法：薄层色谱法、HPLC、ELISA。

3.2 薄层色谱法 原理：用三氯甲烷-磷酸（0.1mol/L）或石油醚-甲醇/水提取样品中OTA，净化浓缩后薄板展开，根据样品在紫外光灯下，OTA标准点相应处产生黄绿色荧光的强度，与标准比较确定含量。 样品处理：样品用三氯甲烷和0.1mol/L磷酸提取，OTA在酸性条件下进入有机相，过滤加碳酸氢钠溶液碱化，OTA进入水相分离后碳酸氢钠水层用稀盐酸溶液调节pH2-3，用三氯甲烷振摇提取分层后，挥干三氯甲烷加入苯-乙腈（98＋2）溶解残渣，供TLC用。

测定方法：滴加标准、样品、样品＋标准三个点。先用横展剂乙醚或乙醚-甲醇-水（94＋5＋1），将薄层板纵展2-3cm，此时OTA不动而杂质向前移动。取出挥干，再将该薄层板靠近标准点的长边置于同一展开槽内的溶剂进行横展，使杂质偏离点样点，与OTA 分离，避免了杂质荧光的干扰。然后将经横展后的薄层板纵展，纵展剂为甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水（6＋3＋1.2＋0.06）或甲苯-乙酸乙酯-甲酸（6＋3＋1.4），苯-冰乙酸（9＋1）。365nm下紫外观察，若与标准点处有荧光点则估计稀释倍数，再点样。同时做确证实验。

确证实验：用碳酸氢钠乙醇溶液喷洒薄层色谱板，干燥于长波紫外灯下观察，这时OTA荧光点应由黄绿色变为蓝色，而且荧光强度有所增加。 方法说明：点样量若超过了硅胶的吸附能力，原点上的杂质和残留的溶剂在横展中可将OTA点横向拉长，可根据荧光强度于标准对比，估计减少的加样体积或所需稀释的倍数；OTA标准液应用黑纸遮光；最低检出限为10ppb。

第四节 展青霉素的检验 4.1 概述 4.2 双向薄层扫描测定法

4.1概述 理化性质：展青霉素（patulin）为无色结晶，70-100℃可升华，分子式C7H6O4，溶于水和乙醇。在碱性溶液中很不稳定，酸性溶液中较稳定，耐热。

展青霉素（Patulin, Pat) OH 结构 O O O

展青霉素（Patulin, Pat)毒性 3. 毒性作用 (1) 急性和亚急性毒性 3. 毒性作用 (1) 急性和亚急性毒性 啮齿类动物的急性毒性中毒：痉挛、肺出血、皮下组织水肿、无尿，死亡。   (2) 致癌、致畸和致突变性 皮下注射部位引起雄性大白鼠发生局部肉瘤，经口服的实验动物未发现致癌现象。Pat对大鼠和小鼠没有致畸作用，但对鸡胚有明显的致畸作用。

展青霉素（Patulin, Pat)毒性 (3) 细胞毒性：Pat能改变细胞膜的通透性，更利于K+外流。 (4) 对免疫系统的影响：亚致死剂量的Pat对小鼠和兔的免疫系统均有影响，Pat的免疫抑制作用是可逆的而且Pat对免疫球蛋白水平的影响具有时间依赖性。

展青霉素的污染 食品中的主要来源：是由荨麻青素、扩张青素和棒曲霉等霉菌代谢产生的，存在于腐烂水果及果汁制品中。

苹果和山楂制品中展青霉素限量卫生标准 品 种 指标(μg/Kg ) ≤ 100 ≤ 50 半成品（原汁、原酱） 原汁、果酱 果酒 罐头 品 种 指标(μg/Kg ) 半成品（原汁、原酱） ≤ 100 原汁、果酱 ≤ 50 果酒 罐头 山楂条（饼）

4.2 双向薄层扫描测定法 原理：用乙酸乙酯提取果汁，用1.5％碳酸钠净化样品。经双向薄层展开分离后，用薄层扫描仪进行紫外反射光扫描定量。 样品处理：鲜果、果酱加适量无水硫酸钠研磨吸收多余水分，加乙酸乙酯震荡提取过滤，滤液加稀碳酸钠振摇去杂质，乙酸乙酯在水浴上真空减压浓缩近干，用少许三氯甲烷定容供TLC用。果汁、果酒直接提取。

测定：在薄板上滴加标准液、样品液。在样品点同一垂直线上距顶端2cm处点标准液，作为位置参考点。先用横展剂三氯甲烷-丙酮横向展开后再用甲苯-乙酸乙酯-甲酸纵向展开，254nm下观察，若在Rf 0.35处有黑色斑点需做确证实验。将薄板喷3-甲基，2-苯并噻唑酮腙盐酸溶液，135℃烘烤15min，360nm下观察，呈橙黄色斑点即可确认。稀释后点样使其在线性范围内，双向展开后进行扫描定量。 最低检出限3μg/L。

水解产物与标准葡萄糖、果糖、蔗糖、木糖溶液对照进行薄板层析，展开剂为正丁醇：无水乙醇（酸）：水＝4:1:5（V/V，上层液），以苯胺－邻苯二甲酸为显色剂，得到右图。 图3.9 β-(1,3)-D-葡聚糖水解产物的层析

镰刀菌毒素 1. 单端孢霉烯族类 （T-2毒素、脱氧雪腐镰孢菌烯醇等） 2. 玉米赤霉烯酮类 3. 丁烯酸内酯 4. 串珠镰刀菌素

单端孢霉烯族化合物 1）主要产毒菌株：镰刀菌属 2）结构与性质 基本结构：倍半萜烯 毒性化学结构：C－12，C－13环氧基 3）性质：稳定、烹调过程不易破坏 碱性条件下次氯酸钠可使之失去毒性。

单端孢霉烯族化合物种类与毒性 种类：40余种 毒性作用： 共同特点表现为较强的细胞毒性、免疫抑制及致畸作用，部分有较弱的致癌性， 急性毒性强，可致人与动物的呕吐。

第五节 脱氧雪腐镰刀菌烯醇和雪腐镰刀菌烯醇的检验 第五节 脱氧雪腐镰刀菌烯醇和雪腐镰刀菌烯醇的检验 5.1 概述 5.2 脱氧雪腐镰刀菌烯醇的薄层色谱测定法 5.3 酶联免疫吸附测定法 5.4 薄层色谱法（同时测定）

5.1概述 理化性质：镰刀菌属产生的有毒代谢产物主要是单端孢霉素类，只含有C、H、O三种元素。谷物种天然污染的有A、B两型，12、13碳原子上形成的环氧基可能为毒性的化学基础。 脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）和雪腐镰刀菌烯醇（nivalenol，NIV）属B型结构式，DON的结构式中R1为-OH，R2为-H，R3、R4为-OH。分子式为C15H20O6，NIV分子式为C15H20O7，溶于甲醇、乙醇和水。

主要来源：主要是雪腐镰刀菌污染谷物和饲料的代谢产物。 毒性与危害：主要为细胞毒性、免疫抑制和致畸、致癌。人中毒后易呕吐，又称呕吐毒素（vomitoxin）。 NIV在急性毒性、皮肤毒性、细胞毒性和其他生物作用方面均比DON强。 卫生标准：我国建议人食用谷物中DON ≤1mg/kg。 分析方法：我国规定标准为TLC和免疫测定法，其他有GC、HPLC和微柱法。

小麦、面粉、玉米及玉米粉中 DON 限量标准 品种 指标(μg/Kg ) 小麦 ≤ 1000 面粉 玉米 玉米粉

5.2 脱氧雪腐镰刀菌烯醇的薄层色谱测定法 原理：谷物及其制品中的DON经提取、净化、浓缩后经硅胶展开，加热薄板。由于有三氯化铝因此在365nm紫外光下显蓝色荧光，与标准比较。 样品处理：提取，准确称取粉碎样品加三氯甲烷-无水乙醇（8＋2）提取，过滤后水浴挥干；净化，石油醚溶解残渣转入分液漏斗再用甲醇-水（4＋1）分次洗涤，转入同一漏斗振摇，DON留在甲醇-水层，油脂进入石油醚层，将甲醇-水层加入装有氧化铝和活性炭的层析柱再用甲醇-水（4＋1）洗脱；浓缩，洗脱液水浴挥干趁热加入乙酸乙酯加热至沸腾，将残渣中DON溶出，冷却后转入浓缩瓶浓缩定容。

测定方法：在硅胶板上点样液，同时在板上端与样品点相对位置上点一个标准点作为定位参考，用乙醚-丙酮（95＋5）或无水乙醚横展使DON偏离原点，挥干后再点上2个等量标准点，其中一个加上样液。用纵展开剂三氯甲烷-丙酮-异丙醇（8＋1＋1）或三氯甲烷-丙酮-异丙醇-水（75＋10＋15＋1）展开。晾干后365nm下观察，干扰点显蓝紫色荧光DON无荧光。将薄板130℃加热后冷却，再观察，DON和干扰点均有荧光且斑点明显分开。 横展后DON移动0.7-1.0cm。

5.3 酶联免疫吸附测定法 原理：将已知抗原吸附在酶标微孔板表面，洗除未吸附抗原，加入一定量抗体与待测样品提取液的混合液，竞争孵育后，在固相载体表面形成抗原抗体复合物，消除多余抗体成分，然后加入酶标记的第二抗体，与吸附在固体表面的抗原抗体复合物相结合，再加入酶的底物，在酶的催化作用下，底物发生反应，生成有色物质，根据标准和样品的吸光度值，计算样品中的抗原含量。 样品处理：同5.2，浓缩瓶95℃水浴挥干，用pH7.4含20％甲醇的碳酸盐缓冲液定容，供检测。 测定方法：同2.3，用酶标仪在波长450nm下测A值。

5.4 薄层色谱法（同时测定） 原理：同5.2 样品处理：提取，准确称取粉碎样品用甲醇-水（96＋4）提取2次过滤。加石油醚洗涤取甲醇-水层，水浴浓缩；净化，浓缩液加水稀释后加入XAD-4树脂，蒸馏水淋洗，用甲醇分次洗提毒素，水浴挥干用甲醇溶解 测定方法：取2块板同5.2处理。DON用乙醚横展NIV用三氯甲烷-丙酮-异丙醇-水（4＋2.5＋3.5＋0.6）横展。再分别用三氯甲烷-丙酮-异丙醇（8＋1＋1）展开DON，用三氯甲烷-丙酮-异丙醇-水（3＋2.5＋4.5＋1.2）展开NIV。

第六节 T-2毒素的检验 6.1 概述 6.2 酶联免疫吸附测定法（间接法）

6.1 概述 理化性质：T-2毒素（T-2 toxin）属单端孢霉烯族化合物中的A型化合物，难溶于水，易溶于三氯甲烷、丙酮和乙酸乙酯。 T-2毒素的三甲硅衍生物具有强的特征质量碎片，可采用GC-质谱联用。 主要来源：三线镰刀菌和拟枝孢镰刀菌代谢产物。小麦、玉米、大麦和燕麦等。 毒性与危害：严重可引起死亡。 卫生标准：我国小麦、玉米及制品低于1000ppb。 分析方法：ELISA、TLC、GC等。

T-2毒素

6.2 酶联免疫吸附测定法（间接法） 原理：同2.3或5.3 样品处理：同5.3 测定：同5.3

第七节 玉米赤霉烯酮的检验 7.1 概述 7.2 分析方法

7.1 概述 理化性质：玉米赤霉烯酮（zearalenone ，ZEN），又称F-2毒素，ZEN白色结晶，溶于碱性水溶液、乙醚、苯、乙醇、三氯甲烷、乙酸乙酯和乙腈，不溶于水、二硫化碳，短波紫外光下呈绿色荧光。对热稳定。 毒性与危害：类雌激素有毒物质。 卫生标准：我国未制定。 分析方法：TLC、GC、ELISA、HPLC等。

主要来源：镰刀菌，污染玉米、小麦、大麦、燕麦、小 米、芝麻、干草和青贮饲料等。

7.2 分析方法 原理：试样中玉米赤霉烯酮用乙腈和氯化钾溶液提取，经异辛烷脱酯、无水硫酸钠脱水、浓缩至干。残渣三氯甲烷溶解，溶液经硅胶柱净化，薄板分离，用薄层扫描仪测定。 样品处理：提取，试样用乙腈和4％氯化钾提取，滤液加异辛烷洗涤，乙腈层经无水硫酸钠脱水浓缩，用少量三氯甲烷溶解残留物；净化，将溶液加入硅胶柱中用三氯甲烷-丙酮（8＋2）洗脱，水浴浓缩。 测定：取等量标样和样品液在硅胶板上点样，展开剂三氯甲烷-丙酮-乙酸-水（18＋2＋8＋1），薄层色谱扫描仪进行测定。

复习内容 NIV在急性毒性、皮肤毒性、细胞毒性和其他生物作用方面均比DON强。