Journal of Bone and Mineral Research Tumor Necrosis Factor α Suppresses the Mesenchymal Stem Cell Osteogenesis Promoter miR-21 in Estrogen Deficiency–Induced Osteoporosis Journal of Bone and Mineral Research IF: 6.589， 2013 Reporter: Tian Wang November 17th, 2014 IMI CONFIDENTIAL

背景 雌激素缺乏引起的骨质疏松主要由一些炎症因子（TNF-α, IL-1, IL-6, IFN-γ）的过表达而产生； 研究表明MicroRNA在骨生成中有重要的作用，并且受一些炎症因 子的调控； 因此，该研究的目的在于探讨MicroRNA在雌激素缺乏引起的骨质 疏松中的作用及机制。 间充质干细胞（MSCs）属于多能干细胞，是成骨细胞和骨细胞的 起源，因此MSCs作为该研究的对象。 IMI CONFIDENTIAL

技术路线 miR-21 overexpression TNF-α induction MSCs from healthy human and patients MSCs from healthy and OVX mice Detection of TNF-α, miR-21 osteogenic differentiation IMI CONFIDENTIAL

骨质疏松患者和动物模型的鉴定与miRNA筛选 与健康人（鼠）相比，骨质疏松患者（模型动物）MSCs中的成骨标志性分子runx2和osterix显著降低，并且骨组织明显受损。（数据未提供） 对模型小鼠MSCs的总RNA进行微阵列分析，有7种miRNA表达量发生改变，与文献比对后，推测miR-21可能是关键的miRNA。 IMI CONFIDENTIAL

雌激素缺乏引起的骨质疏松中miR-21表达的降低可能跟TNF-α 的升高有关 IMI CONFIDENTIAL

MiR-21促进MSCs的成骨分化 IMI CONFIDENTIAL

MiR-21促进MSCs的成骨分化 IMI CONFIDENTIAL

MiR-21 靶向spry1 的3’非翻译区以及spry1在MSCs成骨分化中的作用 IMI CONFIDENTIAL

MiR-21 靶向spry1 的3’非翻译区以及spry1在MSCs成骨分化中的作用 IMI CONFIDENTIAL

MiR-21 过表达能够促进骨质疏松模型小鼠的成骨分化并抑制spry1的表达 IMI CONFIDENTIAL

MiR-21过表达能够改善被TNF-α 抑制的MSCs成骨分化并抑制Spry1的表达 IMI CONFIDENTIAL

阻断TNF-α能够提高骨质疏松小鼠中miR-21-Spry1的表达并促进骨的形成 IMI CONFIDENTIAL

阻断TNF-α能够提高骨质疏松小鼠中miR-21-Spry1的表达并促进骨的形成 IMI CONFIDENTIAL

结论 在激素缺乏引起的骨质疏松中，TNF-α抑制miR-21的表达为主要作用机制； 在MSCs中，miR-21是通过靶分子spry1而产生作用的。 IMI CONFIDENTIAL

第二部分--RNA 干扰 RNAi是与靶基因序列同源的双链RNA(dsRNA)所诱导的一种特 异性基因沉默现象。它是真核生物中存在的一种抗病毒入侵、抑制转 座子活动、调控基因表达的监控机制，具有重大生物学意义。  RNA干涉（RNAi）在实验室中是一种强大的实验工具，利用具 有同源性的双链RNA诱导序列特异的目标基因的沉寂，迅速阻断基因 活性。 IMI CONFIDENTIAL

dsRNA和siRNA dsRNA (double-stranded RNA)： 双链RNA，是一种有互补链的RNA，在细胞内抑制同源序列的基因表达。 siRNA (small/short interfering RNA)：小或短干扰RNA，是一类20-25个核苷酸长度的双链RNA分子，其主要在RNAi通路中起作用，干扰特异基因的表达。siRNA与靶标基因编码区或UTR区完全配对，降解靶mRNA。 IMI CONFIDENTIAL

bla microRNAs microRNAs (miRNA)是长度在21-23个核苷酸之间的单链RNA片段，调节基 因的表达。miRNA由基因编码，从DNA转录而来，但不翻译成蛋白。识别并 与靶标基因3′UTR区部分配对，从而抑制靶标基因的翻译。 与靶mRNA不完全互补的miRNA在蛋白质翻译水平上抑制其表达，使用这 种机制的miRNA结合位点通常在mRNA的3’端非翻译区。 如果miRNA与靶位点完全互补（或者几乎完全互补），那么这些miRNA的 结合往往引起靶mRNA的降解。通过这种机制作用的miRNAs结合位点通常都 在mRNA的编码区或开放阅读框中。 每个miRNA可以有多个靶基因，而几个miRNAs也可以调节同一个基因。 成熟的miRNA结合到与其互补的mRNA的位点通过碱基配对调控基因表达 IMI CONFIDENTIAL bla

siRNA和miRNA的共同点 相同点 siRNA miRNA 长度及特征 都约在22nt左右，5’端是磷酸基，3’端是羟基 合成的底物   siRNA和miRNA的共同点 相同点 siRNA miRNA 长度及特征 都约在22nt左右，5’端是磷酸基，3’端是羟基 合成的底物 miRNA和siRNA合成都是由双链的RNA或RNA前体形成的 Dicer酶 依赖Dicer酶的加工，是Dicer的产物，所以具有Dicer产物的特点 作用方式 都可以阻遏靶标基因的翻译，也可以导致mRNA降解，即在转录水平后和翻译水平起作用 进化关系 可能的两种推论：siRNA是miRNA的补充，miRNA在进化过程中替代了siRNA IMI CONFIDENTIAL

siRNA和miRNA的区别 不同点/分歧点 siRNA miRNA 直接来源 长链dsRNA 发夹状pre-miRNA 分子结构 双链   siRNA和miRNA的区别 不同点/分歧点 siRNA miRNA 直接来源 长链dsRNA 发夹状pre-miRNA 分子结构 双链 单链 对靶RNA特异性 较高 相对较低 成熟过程 dsDNA在Dicer酶切割下产生 pre-miRNAs由Dicer酶切后形成 互补性 一般要求完全互补 不完全互补，存在错配现象 对RNA的影响 降解目标mRNA；影响mRNA的稳定性 在RNA代谢的各个层面进行调控；与mRNA的稳定性无关 作用位置 mRNA的任何部位 靶标基因3’-UTR区 生物学意义 siRNA不参与生物生长，原始作用是抑制转座子活性和病毒感染 miRNA主要在发育过程中起作用，调节内源基因表达 IMI CONFIDENTIAL

shRNA shRNA (short hairpin RNA): 短发卡RNA，是一段具有紧密发卡环的RNA序列，常被用于RNA干扰沉默靶基因的表达。利用载体把shRNA导入细胞，载体中的U6 启动子确保shRNA总是表达；这种装载了shRNA载体可被传递到子代细胞中去，从而使基因的沉默可被遗传。shRNA的发卡结构可被细胞机制切割成 siRNA，然后siRNA结合到RNA诱导沉默复合物上 (RNA-induced silencing complex, RISC)，该复合物能够结合到目的mRNAs并将其降解。 IMI CONFIDENTIAL

dsRNA介导的同源性靶mRNA降解过程 第一步（起始阶段）是较长dsRNA在ATP参与下被RNaseⅢ样的特异核酸酶切割加工成21~23nt的由正义和反义链组成的小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）。 IMI CONFIDENTIAL

dsRNA介导的同源性靶mRNA降解过程 第二步（效应阶段）是siRNA 在ATP参与下被RNA解旋酶解旋成单链，并由其中反义链指导形成RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex，RISC)。在ATP酶的作用下，活化的RISC以单链siRNA为向导识别同源性的单链靶mRNA，并在距离RISC的3’端11个碱基位置切割靶mRNA，导致靶基因的沉默。 RISC由siRNA、解旋酶、ATP、核酸内切酶、核酸外切酶等多种成分组成。 IMI CONFIDENTIAL

Dicer RISC 碱基互补 酶解 第一步 第二步 IMI CONFIDENTIAL

RNAi研究的一般技术路线 IMI CONFIDENTIAL

实验中常用RNAi方法的比较 shRNA表达载体 化学合成siRNA 重复利用 通过转化抽质粒重复利用 不可重复使用 基因沉默效率 ≥70% 制备所需时间 2-3周 4天-2周 转染难易程度 中等 易转染 可筛选性 可以 不可以 能否长效抑制 不适用 细胞中存在时间 较长 短 IMI CONFIDENTIAL

第三部分-案例分析 问题 Short contribution=short communication Original article? Short communication? 撤稿的理由是否充分 分析 撤稿需谨慎 跟客户做好沟通 IMI CONFIDENTIAL

Thank you for your attention! IMI CONFIDENTIAL