口腔微生物研究方法

显微镜检查法(Microscope) 　　形态、菌数、菌比

光学显微镜 G+、G- 球菌 长：宽 1：1－2：1 杆菌 2：1－6：1 丝菌 6：1↑

暗视野显微镜 每视野15－30个菌为佳，约200个菌 螺旋体、活动菌、球菌、杆菌

扫描电镜，透射电镜 超微结构 激光共聚焦显微镜 动态观察，三维结构、空间定位

图1 96h 血链球菌生物膜

图2 96h 伴放线放线杆菌生物膜

图3 96h血链球菌和伴放线放线杆菌生物膜

图4 24h 8种菌株生物膜的三维立体图象

图5 96h 8种菌株生物膜

图6 96h 8种菌株生物膜的三维立体图象 白色箭头所指处为管道结构

分类、生物学特性、药敏、深入研究（致病性、毒力因子） 细菌培养法(Culture) 　　分类、生物学特性、药敏、深入研究（致病性、毒力因子）

采样(sampling)─定位，勿污染其他部位 龈上菌斑(致龋菌)─需氧或微需氧 饭后2~3h 采集前漱口，生理盐水冲洗采集区，吸干 控匙刮取 龈下菌斑(致牙周病菌)─厌氧或微需氧 采集前漱口，生理盐水冲洗，棉卷隔湿 龈上洁治器去除龈上菌斑 控匙伸入牙周袋底部刮除(带充气导管的采染皿)

龈沟液(非附着性龈下菌斑) 滤纸吸着法：1~2mm细长滤纸片. 6mm直径圆滤纸片 龈沟液(非附着性龈下菌斑) 滤纸吸着法：1~2mm细长滤纸片 6mm直径圆滤纸片 无菌纸尖 毛细管法 龋沟液测定仪(periotron)－电子测定仪 唾液 非刺激性唾液 刺激性唾液

涂沫(smear) 显微镜下观察 （能增培养的菌＜1/5） 运输(transport)

分散(dispersion) 稀释(dilution) 超声波 30秒钟 磁力搅拌器搅拌 1分钟 系列10倍稀释 菌斑 10-4~10-10 超声波 30秒钟 磁力搅拌器搅拌 1分钟 稀释(dilution) 系列10倍稀释 菌斑 10-4~10-10 龈沟液、唾液 10-3~10-8

接种(inoculation)、分离(isolation) 培养(incubation) 玻棒涂布接种 平板划线分离 需氧培养：空气 微需氧（兼性）培养：95%N2 5%CO2 厌氧培养：80% N2 10%CO2 10%H2 *操作过程中的无菌观念

细菌鉴定(Identification) 菌落、菌细胞、染色、生化反应

刚果红染色法 (Congo red negative staining) 原理：酸性染料刚果红将背景染上色，菌体不着色 方法：0.5%刚果红1~2滴于载玻片上，加同体积菌液，室温风干，1%盐酸冲洗 结果：菌体无色(透明体)，背景蓝色，死菌可被染色

BANA法 牙龈卟啉单胞菌(Pg) 福赛似杆菌(Bf) 齿垢密螺旋体(Td) 敏感度 81% 特异性 78% 准确度 80% 快速检测 敏感度　81% 特异性　78% 准确度　80% 快速检测 原理：胰蛋白酶样酶可水解苯甲酰精氨酰奈酰胺(BANA－人工合成天然底物) 方法：BANA卡，上方浸Evan’s黑色染料，下方浸BANA处接种细菌，中线折起，相互接触，35 ℃，孵育15min 结果：上方染料显色程度－阴性:无蓝色 阳性:浅蓝色 　 强阳性:蓝色

菌种保存(Storage) 不污染、不变异、不死亡

细菌毒力的检测方法

直径0.5cm玻棒插入菌液 新鲜培养液 洗脱液 分光光度计测OD值 细菌粘附能力 培养24h 直径0.5cm玻棒插入菌液　　　　新鲜培养液　　洗脱液 分光光度计测OD值

胞外多糖定性检测 　酒精沉淀试验 胞外葡聚糖 TSB＋5％蔗糖+细菌如Sm培养过夜，在室温下放24h 细菌悬液1ml＋95%乙醇2ml 静置后有沉淀产生即阳性

pH测定 牙菌斑、龈沟液、唾液 细菌培养液

pH试纸 　1-14 　0.5-5.0 锑电极或玻璃电极 　每次测定时需用2个标准pH液作校正 　　如pH4.0 pH6.86 　锑电极或玻璃电极放入6ml溶液中，读数30秒 微型玻璃电极或锑电极 　直接插入牙菌斑中──不锈钢超细探头0.8mm

鲎试验(limilus test)──试管法 原理： 鲎血液的变形细胞含一种凝固酶，经极微量内毒素激活后，使细胞溶解物中的凝固蛋白元转变成凝固蛋白，形成凝胶，凝胶程度与内毒素量有关

方法 等量鲎试剂与样本混合，置37℃水浴1小时。 结果 阴性(-) 液体流动（无变化或浊度增加） 弱阳性(+) 半流动凝胶（具粘性） 阳性(++) 倾斜45℃，凝胶变形，但不流动 强阳性(+++) 试管倒置，固体凝胶不变形

用途 检测药物、生物、食品中内毒素污染 检测脑脊液、血、尿及体液等内毒素量 优缺点 简单易行 仅能半定量 鲎试剂用量大 注意事项 所有器材必须无热源 每次试验必须做阴性和阳性对照 孵育过程中不得振动

鲎试验──合成基质偶氮显色法 原理： 内毒素激活鲎试剂中的凝固酶，去水解鲎三肽中精氨酸肽链，释放出对硝基苯胺，可与偶氮试剂反应，形成玫瑰红色的偶氮蓝复合物，在545nm处有最大吸收峰，在适当条件下，内毒素浓度与吸光度A值之间有较好的线性关系

方法 待测内毒素样本0.1ml+鲎试剂0.05ml，37℃ 25分钟 鲎三肽0.05ml，37℃ 3分钟 冰－水终止反应 偶氮试剂（亚硝酸钠、氨基磺酸胺、苯乙二胺） 545nm测吸光度A

优缺点 定量检测微量内毒素 灵敏度、特异性、精确度高 需先做内毒素标准品显色的标准曲线或回归方程