第二章 发酵工程基础知识

2.1 发酵工程研究及工艺流程 2.1.1发酵工程研究内容 (1)． 上游工程 ①优良菌种的选育 2.1 发酵工程研究及工艺流程 2.1.1发酵工程研究内容 (1)． 上游工程 ①优良菌种的选育 ②最适发酵条件（pH、温度、溶氧、和营养组成）的确定 ③培养基的优化

(2)．发酵工程 ①最适发酵条件下，发酵罐中大量培养细胞和生产代谢产物的工艺技术 ②提供严格无菌生长环境，包括发酵开始前采用高温高压对发酵原料和发酵罐以及各种连接管道进行灭菌技术。 ③在发酵过程中根据细胞生长要求控制加料速度的计算机控制技术 ④种子培育和生产培养的不同工艺技术 ⑤间歇投料发酵，流加投料发酵，连续发酵技术 ⑥小试，中试及大规模生产的放大技术

(3)． 下游工程 ①发酵液中分离和纯化产品的技术（离心、过滤、沉淀） ②细胞破壁技术（超声、高压剪切、渗透压、表面活性剂、溶壁酶） ③蛋白质纯化技术（沉淀法、色谱分离法、超滤法） ④产品包装处理技术（冷冻干燥、真空干燥）

二． 发酵工程一般工艺流程

典型的发酵过程示意图

1、菌种的选育 4、 2、 3、 5、发酵过程（中心阶段） 6、产品的分离提纯

豆饼的水解液、玉米浆、尿素、磷酸氢二钾、氧化钾、硫酸镁、生物素等（＿＿＿＿＿＿＿） 应用发酵工程的生产实例 豆饼的水解液、玉米浆、尿素、磷酸氢二钾、氧化钾、硫酸镁、生物素等（＿＿＿＿＿＿＿） 天然液体培养基 菌种－ 发酵罐 灭菌、冷却 条件控制－ 谷氨酸 加工－ 产品 Na2CO3溶液中和、过虑、浓缩、离心分离等 谷氨酸棒状杆菌、黄色短杆菌 温度、pH、时间、氧气

发酵工程的概念和内容 菌种选育 分离纯化 培养基配制 发酵过程（中心阶段） 灭菌 扩大培养和接种 自然界选种、诱变育种、基因工程、细胞工程 菌　　体：过滤、沉淀　　　代谢产物：蒸馏、萃取、离子交换 培养基配制 发酵过程（中心阶段） 根据培养基的配制原则制备，实践中需多次试验配方 检测进程，满足营养需要；严格控制温度、pH、溶氧、转速等 灭菌 扩大培养和接种 杀灭杂菌（胞体、孢子及芽孢）

2.2、微生物菌种的扩大培养 现代的发酵工业生产规模越来越大，每只发酵罐的容积有几十立方米甚至几百立方米，要使小小的微生物在几十小时的较短时间内，完成如此巨大的发酵转化任务，那就必须具备数量巨大的微生物细胞才行。

种子扩大培养的过程： 就是要为每次发酵罐的投料，提供相当数量的代谢旺盛的种子。 菌种扩大培养的目的： 就是要为每次发酵罐的投料，提供相当数量的代谢旺盛的种子。 因为发酵时间的长短和接种量的大小有关，接种量大，发酵时间则短。将较多数量的成熟菌体接入发酵罐中，就有利于缩短发酵时间，提高发酵罐利用率，并且也有利于减少染菌的机会。 种子扩大培养的过程： 斜面菌种 一级种子培养 二级种子培养 发酵罐

种子罐级数 是指制备种子需逐级扩大培养的次数，一般根据种子的生长特性、孢子发芽及菌体繁殖速度，以及发酵罐的容积而定。对于生长快的细菌，种子用量少，故种子罐数相应也少。如谷氨酸生产，种子接入种子罐后于32℃培养7-10h，菌体浓度达到108-109个/ml，即可接入发酵罐作为种子，这称为一级种子罐扩大培养，也称二级发酵。 °

生长较慢的菌种，如青霉素生产菌种，种子接入一级种子罐27℃培养40h后，再需移入装有新鲜培养基的第二级种子罐，于27℃培养10-24h移至发酵罐作为种子，这称为二级种子罐扩大培养，也称三级发酵。一般50m3发酵罐都采用三级发酵。

种子扩大培养流程图 生产车间种子制备阶段 实验室种子制备阶段 （二级种子培养、 三级种子培养） （一级种子培养） 二级发酵 三级发酵 摇瓶液体培养 冷冻干燥孢子 茄子瓶斜面培养 一级种子罐 二级种子罐 发酵罐 斜面孢子 砂土孢子 固体培养基培养 生产车间种子制备阶段 （二级种子培养、 三级种子培养） 二级发酵 三级发酵 实验室种子制备阶段 （一级种子培养）

3.2.1种子扩大培养的任务和培养类型 1.任务：不但要得到纯而壮的培养物，而且要获得活力旺盛的、接种数量足够的培养物。 每次发酵罐的投料，要提供相当数量代谢旺盛的种子。根据菌种生长速度快慢来决定扩大培养的级数； 2.培养类型 ⑴静置培养法（厌气性发酵）； ⑵通气性培养（好气性发酵）；

①液体培养法：三角瓶摇床震荡或旋转式培养； 作为种子扩大培养的方法： ①液体培养法：三角瓶摇床震荡或旋转式培养； ②表面法培养：液体表层； ③固态法培养:

大规模发酵工程生产的培养方法及特点： ⑴固体培养（曲法培养） ①浅盘固体培养 ⑵液体培养 ①浅盘液体培养 ②深层固体培养 ⑵液体培养 ①浅盘液体培养 ②液体深层培养 ⑶载体培养：吸收了固态的曲法培养与液态培 养的优点，是近年新发展的一种培养方法； ⑷两步法液体深层培养：在酶制剂和氨基酸生产中应用较多。控制菌体在不同生长期的条件。

附种子的培养过程

3.2.2 影响发酵种子质量的主要因素 1.培养基 主要是碳源、氮源、无机盐、生长素和水等。 2.培养条件 选用原则：组分简单，来源丰富，价格便宜，取材方便等。 2.培养条件 ①温度：温度直接影响生长和酶的合成； ②pH值：对微生物有明显的影响。 ③通气搅拌：（溶解氧的作用：参与菌体呼吸作用） ④泡沫(危害：影响微生物对氧的吸收；妨碍CO2的排除；减少设备利用率)

染菌原因：设备、管道、阀门漏损、发酵罐结构“死角”、灭菌不彻底、空气净化不好、无菌操作不严、菌种不纯； 3.染菌的控制 染菌原因：设备、管道、阀门漏损、发酵罐结构“死角”、灭菌不彻底、空气净化不好、无菌操作不严、菌种不纯； 4.种子罐级数 种子罐级数取决于： ①种子的性质（生长繁殖性能）； ②孢子瓶中孢子的密度（密度大则级数少）； ③孢子发芽及菌丝繁殖速度； ④发酵罐中种子的最低接种量； ⑤种子罐与发酵罐的容积比；

3.3 发酵工艺方式 (1)．间歇发酵 指在灭菌后的培养基中,接种以某种活的生产菌,而不再向发酵液加入或移出任何物质的发酵方式.此过程中微生物所处环境不断变化,即发酵罐内的化学及物理状态随时间变化,整个发酵过程处于非定常态.但是当菌体生长最适条件与代谢产物生成最适条件不同时,可在培养过程中人为改变这些条件,以获得最大产率.

(2)．连续发酵 通过连续流加新鲜培养基并以同样流量连续地排放出发酵液,可使微生物细胞群体保持稳定生长环境和生长状态,并以发酵液中各个变量多能达到恒定值而区别于瞬变状态的间歇发酵.其最大特点是微生物细胞生长速度、代谢活性处于恒定状态，达到稳定高速培养微生物并产生大量代谢产物的目的，但这种恒定状态与细胞生长周期中稳定期有本质区别。

实际生产是各种发酵方式结合进行，选择哪些方式进行发酵取决于菌种特性，原料特点，产物特性，设备状况，技术可行性，成本核算，现代发酵工业大多是好氧液体深层、游离、单一纯种发酵方式进行。

3.4 发酵工艺规模 (1)．发酵工程最重要和最复杂的一个方面是从小规模实验装置向大规模工业化装置转化过程即发酵工艺规模逐级放大。

(2)请注意几乎没有一个发酵过程，小规模实验装置与大规模生产型发酵罐是相同的 其原因： 搅拌和通气在小实验室烧瓶中比大的工业发酵罐更容易完成，随着设备规模增加，其表面积与体积的比发生变化，对已知表面积，大发酵罐有更大体积，因为与发酵罐体积相比，气体传送和搅拌更依赖于暴露表面积，所以在大发酵罐中搅拌明显比烧瓶中困难，

由于大多数工业发酵采用好氧菌，所以有效氧气传送是关键，随着营养丰富培养基在工业过程中的应用，可获得较高生物量，从而导致较高需氧量，如果通气量减少，即使短时间培养会经历部分无氧条件，使产物产量上受到严重影响。 工业发酵工程研究人员也应熟悉传送气体、流体动力学，搅拌和热力学，也应掌握微生物学、遗传学、生物化学、化工、机械、分子生物学、工程、计算机、企业经营管理。

3.5 发酵规模 (1)．发酵规模 从实验小型设备发酵至大规模设备工业发酵生产逐级放大，各阶段不是设备简单放大，需使工艺条件调节：温度、pH、溶解氧、细胞生长、产物形成等发酵参数适宜于放大设备，每个阶段对研究开发生产新的发酵产品都是不可缺少的。

(2)．发酵规模 ① 小试 一般指采用实验室小型设备包括三角瓶，1~50 L发酵罐，实验室其它常规设备等进行实验，该阶段要求对培养基成分和配比、pH、温度、通气量等发酵条件进行大量试验，获得众多试验数据资料，得出小试中发酵最佳条件，从而结合小试阶段对产物初步功能性、安全性、结构分析等试验结果，达到小试目标，初步评估出所发酵产物是否具有效益和生产可能性。

瑞士比欧公司生产L1523型机械搅拌通风发酵罐 1、罐体 2、搅拌装置 3、加热及冷却装置 4、通气及排气 5、测量装置（温度、搅拌转速、pH、pO2、泡沫） 6、接种 7、取样及排料 8、空气产生、净化、计量 9、控制装置

主机 发酵罐 计算机

发酵罐试验 菌种筛选 摇瓶试验

② 中试 一般指采用试验工程或者车间小规模设备如 100~5000 L发酵罐，与其相适应分离过滤、提取、精制等设备，根据小试阶段获得最佳发酵条件进行放大试验，该阶段要求对发酵小试中最佳发酵条件进行验证、改进，使其更接近大规模发酵生产，并初步核算生产成本，为工业发酵生产提供各种参数，还要提供足够量产物，进行正式功能性，安全性质量分析鉴定等试验，取得有关具有法律效力新产品等文件，从而达到中试目标，基本确定发酵产物能否进行工业性大规模生产，初步确定生产该产品必要性和可行性。

③ 大试 也可称为试验性生产或者工程性试验研究，是指用工业性大规模设备包括大型发酵设备、分离、过滤、提取、纯化等大型设备，根据中试阶段获得最佳发酵条件参数进行试验性生产，该阶段要求对中试中最佳发酵条件进行验证、改进，生产出质量合格具有经济价值商业性产品，并核算成本，制定出生产规模等，取得具有法律效力生产许可证等相关证书，从而达到大试目标，确定发酵产物能否进行工业性大规模生产，生产该产品必要性和可行性。

(3)．发酵指标 （1）底物转化成产品的比率，按此比率就能确定原料对产品成本的影响，转化率越高，产品成本越低。 （2）产率即反应器或者发酵罐在单位时间内，单位容积内制造出成品或者半成品数量，由于产率跟反应速率有关联，据此就能确定反应器或者发酵罐容积，就能确定符合需要投资。 （3）发酵产物浓度，据此就能确定一个提取和精制费 用。 （4）残留底物量，据此确定实际转化率和防治杂菌污染费用。

(4) 发酵工艺规模 改进现行深层发酵，应从下列几个方面考虑 (4) 发酵工艺规模 改进现行深层发酵，应从下列几个方面考虑 ①研究在发酵罐条件下影响微生物生长各种因子，如微生物在连续培养，高浓度底物和产物对质粒稳定性和表型等的影响，物理力影响进行模拟放大。 ②发展具有微处理计算机和新型探头发酵罐，使发酵反应更可靠，有效及低能耗。 ③改进工艺操作包括热质传递，混合，产品最佳化，在高浓度细胞和高温条件下操作，细胞再循环系统，产品回收。

④研究解决由于难加工原料（粘度大，气相包含有固相悬浮物等）和难度大产品（高分子，粘度大，表面活性）所带来的问题。 ⑤减少投资额，这包括发酵罐类型，能量平衡，设计简化，非灭菌发酵。

(5). 适合发酵工程菌株必须满足条件 必须是纯培养获得且能稳定遗传，大规模培养 (5). 适合发酵工程菌株必须满足条件 必须是纯培养获得且能稳定遗传，大规模培养 生长迅速，并在相对较短时间内生产所需要产物且能在相对便宜培养基生长 应该对人及重要经济动植物无害。 能从培养基中相对容易除去。 最好能进行基因操作，使可通过突变和筛选的遗传方法获得该菌株。

(6)．发酵工程定义 一门研究大规模利用微生物来生产有价值的工业产品或者进行重要化学转化的学科，起源于酒精发酵过程如制造啤酒、果酒，随后发酵工程得到发展用于制造药剂(抗生素)，食品添加剂（氨基酸工业）生物酶和化学药品如丁醇和柠檬酸。

3.6发酵工程生产工程化控制 基本概念 1.物料衡算 —— 质量守恒 输入量 - 输出量 =累计量 总物料衡算 某物料衡算 总物料衡算 某物料衡算 2.能量衡算 —— 能量守恒 机械能 热能 3.过程速率 —— 发酵过程进行的快慢。 速率 = 过程推动力/过程阻力

4. 物系平衡—— 　　　过程进行的方向和所能达到的极限 5. 经济核算—— 设备费与操作费的总和。

工程的观点：理论上正确性、技术上可行性、操作 上安全性、经济上合理性 工程的观点：理论上正确性、技术上可行性、操作 上安全性、经济上合理性 1、发酵生产过程影响因素多 物性因素(如发酵原料化学特性、密度、粘度)、操作因素(如温度、压力、pH、流量)和结构因素(如发酵设备形状、尺寸)三类。 2、发酵生产过程制约条件多 　　原料来源、冷却水来源、可供应的设备及其结构材料的质量和规格、当地的气温和气压变化范围等等。同时单元设备在流程中的位置也会制约设备的进、出口条件。此外，还受安全防火、环保、设备加工、安装以及维修等条件的制约。 3、发酵生产大多采用经验公式与经验数据指导生产　　 4、经济效益是评价发酵生产技术科学合理的最终评判依据 　　

发酵工程数学研究方法 实验研究法 　　它一般用因次分析法(量纲分析法)为指导，依靠实验建立过程参数之间的相互关系，而且通常是把各种参数的影响表示成为由若干个有关参数组成的、具有一定物理意义的无因次数群(也称准数)的影响。 2. 数学模型法 　　关键是建立数学模型，而反映过程特性的模型参数，它必须通过实验才能确定，因而它是一种半经验、半理论的方法。