第五讲 抗关节炎药物 徐寒梅

关节炎主要包括类风湿性关节炎、骨关节炎、痛风性关节炎、强直性脊椎炎等多种关节疾病，共同的特征是进行性发展的慢性炎症过程。 痛风是由嘌呤代谢紊乱而引起的疾病。表现为尿酸多，尿酸盐在关节、结缔组织、肾脏等处沉积，并析出尿酸钠结晶，尿酸钠结晶能引起粒细胞浸润，粒细胞对尿酸钠进行吞噬而产生炎症反应。

一、抗类风湿药作用机制 抗类风湿药作用机制主要有以下四类： 1．对免疫功能的影响，主要作用于Th细胞。 2．细胞因子及其拮抗剂。 3．对代谢功能的影响 4．新生血管抑制剂类。

二、抗痛风药物作用机制 1．抑制粒细胞浸润药，如秋水仙碱； 2．抑制尿酸生成药，如别嘌呤醇； 3．促进尿酸排泄药，如丙磺舒、磺吡酮、苯溴马隆等； 4．非甾体抗炎药，如吲哚美辛、保泰松、炎痛喜康、萘普生、布洛芬等； 5．糖皮质激素类，如强的松。治疗痛风急性发作，可应用秋水仙碱、非甾体抗炎药和糖皮质激素；控制慢性痛风可用促尿酸排泄药和抑制尿酸生成药。  

三、抗关节炎药物指导原则 创新药： （1）角叉菜胶诱发大鼠足跖肿胀； （2）大鼠棉球肉芽肿； （3）大鼠佐剂性关节炎； （4）淋巴细胞增殖反应； （5）巨噬细胞产生白细胞介素1。

四．抗痛风性关节炎新药： 微晶型尿酸钠（MSU）诱导大鼠足肿胀 MSU诱导兔急性关节炎模型 参照《抗风湿性关节炎新药药效学指导原则》

五、抗关节炎药物药效学试验方法 （一）角叉菜胶诱发大鼠足跖肿胀模型 【基本原理】 角叉菜胶可使致炎的局部前列腺素PG合成增加，并与血管活性物质和激肽类共同诱发水肿。 【操作步骤】 （1）将大鼠右后肢拉直，局部消毒，于后足跖腱膜皮下注入1%角叉菜胶0.05～0.1 ml致炎。 （2）检测：致炎前、致炎后1～6 h，每间隔1 h检测一次。肿胀测量方法有：1）用特制软皮尺测量踝关节周长和千分尺测量肢体肿胀的厚度，该方法比较容易，无需特殊仪器；2）大鼠足跖容积测定仪，该方法读数准确，目前常用。 （3）疗效评价 比较用药组与阴性对照组肿胀度的差异。肿胀率E(%)=1－(Vt/Vn)×100%]，其中Vn、Vt分别代表致炎前后足跖容积值。抑制率I(%)=[1－(Et/Ec)×100%]，其中Ec、Et分别代表对照组和给药组平均肿胀度。

【注意事项及评价】 （1）该模型稳定，能做定量测定，适用于环氧化酶抑制剂的评价。 （2）该模型注入致炎剂要准确，容积测定仪测定前要进行校正。 （3）其他致炎剂：短效致炎剂如鸡蛋清、5-羟色胺及缓激肽等，注射后30 min达高峰，持续1～2 h；中效致炎剂如角叉菜胶、白陶土及酵母等，注射后1～2 h达高峰，持续6～8 h；长效致炎剂如甲醛，注射后24 h达高峰，持续2周。

（二）大鼠棉球肉芽肿模型 【基本原理】 将棉球植入大鼠体内，棉球作为异物，可引起部分与临床炎症后期相似的皮下肉芽组织增生，通常用于评价药物抗结缔组织增生的作用。 【材料与试剂】 动物：雄性Wistar大鼠，体重150 g～180 g。 材料：棉球30 mg，高压灭菌，用时各加入氨苄西林1 mg/0.1 ml/个，50 ℃烘箱2 h备用。 仪器：温控烘箱、分析天平及手术器械。

【操作步骤】 （1）大鼠用乙醚浅麻醉，在无菌操作下，于左、右两侧腋下各植入棉球1个，缝合皮肤。连续给药7 d后，将动物处死，取出棉球，放入小皿内，60 ℃烤箱2 h，称重，减去原棉球重，即为肉芽肿质量。 （2）在术后当天开始给药（灌胃、静脉、腹腔及肌肉注射），连续给药7 d。 （3）疗效评价 比较用药组与阴性对照组肉芽肿的差异。抑制率I(%)=[1－(Et/Ec)×100%]，其中，Ec、Et分别代表对照组和给药组的肉芽肿平均值。

（三）大鼠佐剂性关节炎 【基本原理】 大鼠足跖腱膜下注入完全弗氏佐剂（CFA）引起的多发性关节炎，与人类的类风湿性关节炎非常相似。致炎后24 h出现严重的原发性病变反应，在10 d后出现继发性病变反应，继发性病变以非注射的后足、前足、鼻及尾巴出现病变，体重减轻和免疫反应为特征。在抗关节炎药物的评价过程中，以阻止原发性病变的发生（即“预防性”）和减少继发性病变的发生（即“治疗性”），这两种方法得到广泛应用。

【操作步骤】 （1）模型制备： 选用雄性大鼠，将大鼠右后肢拉直，局部消毒，于右后足跖皮下注入弗氏完全佐剂0.1 ml致炎，诱导关节炎发生。大鼠足跖注入完全弗氏佐剂引起的多发性关节炎，在早期致炎局部出现炎症反应，18 h后右侧足跖肿胀达到高峰，持续3 d左右，8 d后再次肿胀，此过程为原发性病变反应，在10 d后出现继发性病变反应，以左后足、前足、鼻、尾巴为发病部位，体重减轻和免疫反应为特征。

（2）给药方案 1）观察药物对原发性病变的预防作用 ：于致炎前30～60 min给药，测定致炎后18 h、36 h及72 h的足跖肿胀度。 2）观察药物对继发性病变的预防作用： 于致炎后第7 d开始给药，每日1次，连续5～7 d。观察药物致炎后10～28 d左右的足跖肿胀度等指标。 3）观察药物对继发性病变的治疗作用： 于致炎后19 d开始给药，每日1次，连续7 d。观察药物致炎后19～28 d的左右足跖肿胀度等指标。

（3）观察指标 1）关节病变测量指标 ①足跖肿胀度 足跖肿胀度=注射后足跖容积－注射前足跖容积，并与对照组比较，计算药物对原发性病变抑制率，抑制率I(%)=[1－(Et/Ec)×100%]，其中Ec、Et分别代表对照组和给药组平均肿胀度。 ②全身病变指数 指数计分标准为0，无红肿1.0；小趾关节稍有肿胀2.0；趾关节和足跖肿胀3.0；踝关节以下足跖肿胀，体重减轻4.0；双侧后肢踝关节在内全部足跖肿胀。

③关节炎指数 在致炎后21～28 d，用下列评分标准评价继发性病变的严重程度，大鼠致炎后21～28 d中耳、鼻、尾、前足、后足无红肿、无结节及无炎症者计0；耳、鼻有红肿和结节者计1分；尾巴有结节者计1分；前足至少有一个关节炎症者计1分；后足有轻度的炎症者计1分；后足有明显炎症者计2分；后足有重度炎症者（后肢活动困难，着地疼痛）计3分； 2）免疫调节活性检测（致炎后14～21 d）脾T淋巴细胞和B淋巴细胞增殖反应、腹腔巨噬细胞产生IL-1测定。 3）病理组织学检查 取炎症踝关节、脾脏及胸腺进行病理检查。

【注意事项及评价】 （1）模型的成功关键是弗氏完全佐剂制备，美国Sigma公司可提供弗氏完全佐剂，该模型得到广泛应用。 （2）评价药物在对继发性病变的预防和治疗时，各组的关节炎指数和全身病变指数应一致。 （3）动物的种系、性别和年龄对实验有影响。 （4）给予致炎药的部位和药量应准确。

（四）大鼠Ⅱ型胶原蛋白诱导的关节炎 【基本原理】 Ⅱ型胶原蛋白（CollagenⅡ，CⅡ）只存在于机体的透明软骨、眼玻璃体、视网膜和角膜。类风湿性关节炎病人（RA）的血清、关节腔液中可检测到抗Ⅱ型胶原抗体。关节滑膜组织中可检查Ⅱ型胶原-抗Ⅱ型胶原抗体的复合物。注射同源或异源性Ⅱ型胶原蛋白并配合不完全弗氏佐剂可引起大鼠的胶原蛋白性关节炎，该类风湿性关节炎模型（CIA）反应与临床上的类风湿性关节炎（RA）病人形成的免疫反应有相似性，国际上已广泛应用于关节炎基础理论和抗关节炎药物的研究。

（五）淋巴细胞增殖实验（体外法） 【基本原理】 淋巴细胞增殖和分化是机体免疫应答过程的一个重要阶段。因此，检测淋巴细胞增殖水平是细胞免疫研究和临床免疫功能检测的一种常用方法。T细胞、B细胞表面具有识别抗原的受体和有丝分裂原受体，在特异性抗原刺激下可使相应淋巴细胞克隆发生增殖。植物血凝素（PHA）、刀豆蛋白A（ConA）、抗CD2、抗CD3 McAb作为多克隆刺激剂可选择性地刺激T细胞增殖；而抗IgM、含葡萄球菌A蛋白的菌体（SAC）、脂多糖（LPS，对小鼠有作用）则刺激B细胞发生增殖；美洲商陆（PWM）、肿瘤刺激剂PMA对T、B细胞的增殖均有刺激作用。最近发现，integrin家族中VLA组中某些受体与相应配体结合后也能活化T细胞。目前临床上最常选用 PHA刺激 PBMC，根据形态学或氚标记胸腺嘧啶核苷（３H-TdR）掺入率测定T细胞的增殖水平。

常规制备小鼠脾细胞悬液，加入无菌96孔培养板中，然后加入致有丝分裂原（观察对T细胞增殖反应影响加入ConA；观察对B淋巴细胞增殖反应影响时加入LPS）。置5% CO2 37 ℃培养48 h。培养结束前6 h每孔加入3H-TdR 20 μl，使其终浓度在1～5 μci/ml。将细胞收集于49型纤维滤纸上，60 ℃烘干，置盛有5 ml闪烁液的瓶中测定放射性强度（cpm）。 实验应重复4次以上，每组结果以三份复管的cpm均值表示（mean ± SD），并进行显著性检验。

（六）巨噬细胞产生白细胞介素1（interleukin 1, IL-1）实验 【基本原理】 IL-1既是免疫调节因子，又是炎症介质，在风湿性疾病的发生、发展过程中起重要作用。IL-1主要由活化的单核/巨噬细胞产生，具有广泛的生物学活性。检测药物对Mφ产生IL-1的影响，既可了解药物对Mφ功能状态的影响，又可提示药物的作用机理。