医学检验系临床微生物及免疫学教研室 井申荣 第二节 病原性真菌检验 医学检验系临床微生物及免疫学教研室 井申荣

第一部分 病原性真菌概述 真菌（Fungus） 具有典型细胞结构（细胞核、细胞器、细胞壁） 细胞壁含几丁质和（或）纤维素 第一部分 病原性真菌概述 真菌（Fungus） 具有典型细胞结构（细胞核、细胞器、细胞壁） 细胞壁含几丁质和（或）纤维素 无根、茎、叶，不含叶绿素 以腐生或寄生方式摄取养料 能进行有性生殖和（或）无性繁殖

对人类致病的真菌分为： 浅部真菌：侵犯皮肤、毛发、指甲，为慢性，对 　　　　　　　治疗有顽固性，但影响身体较小， 深部真菌：可侵犯全身内脏，严重的可引起死亡。 　　此外有些真菌寄生于粮食、饲料、食品中，能产生毒素引起中毒性真菌病。

一、生物学性状 （一）形态结构 真菌细胞结构比细菌复杂 细胞壁为几丁质(Chitin)（多聚N－乙酰葡萄糖组成），并含葡聚糖，甘露聚糖及蛋白质，某些酵母菌还含类脂体。 细胞内有较为典型的核结构和细胞器。

真菌形态分单细胞和多细胞两类 单细胞真菌主要为酵母和类酵母菌（如隐球菌、念珠菌），呈圆形或椭圆形。以出芽方式繁殖。 多细胞真菌由菌丝和孢子组成 菌丝分枝交织成团，形成菌丝体（Mycelium），并长有各种孢子，这类真菌即一般称为霉菌（Mold）。 由于生活环境（如营养、温度、氧气等）的改变，有些真菌的孢子与菌丝两种形态可以互变，这类真菌称为二相性真菌（dimorphic fungus），如球孢子菌、组织胞浆菌及芽生菌。

真菌孢子和细菌芽胞的区别 真菌孢子 细菌芽胞 抵抗力 不强，60-70短时间杀死 强，煮沸短时间不死 数目 一条菌丝可产生多个孢子 一个细菌体只形成一个芽孢 作用 为繁殖方式之一 不是繁殖方式 形成位置 可在细胞内外形成 只在细菌细胞内形成 形状 形态、色泽多样 圆形或椭圆形

真菌的形态构成 菌 丝 营养菌丝 气生菌丝→ 生殖菌丝 孢 子 有性孢子 由同一菌体或不同菌体上的二个细胞融合形成 菌 丝 营养菌丝 气生菌丝→ 生殖菌丝 孢 子 有性孢子 由同一菌体或不同菌体上的二个细胞融合形成 绝大多数属于非致病性真菌所具有 无 性 孢 子 分生孢子 分生孢子梗的顶端或侧面 大分生孢子 小孢子菌属、 表皮癣菌属 小分生孢子 毛癣菌属 叶状孢子 菌丝细胞直接形成 芽生孢子 隐球菌、念珠菌 关节孢子 厚膜孢子 新型隐球菌 子囊孢子 菌丝末端形成膨大的囊状结构即孢子囊，内含很多孢子 根霉菌

真菌菌丝形态

真菌孢子形态

（二）培养特性 大多数真菌营养要求不高，常用沙保氏培养基 （SDA）培养。 浅部病原性真菌的最适温度为22～28℃，生长缓慢，大多于1～4周出现典型菌落。 深部病原性真菌培养在37℃中生长最好，生长较快，经3-4天即长出菌落。

真菌菌落类型 类型 定义 特征 颜色 举例 酵母型菌落 为单细胞真菌的菌落，形态与一般细菌菌落相似，以出芽形式繁殖 光滑、湿润， 一般为乳白色 新型隐珠菌 类酵母型菌落 外观似酵母菌落，但可见伸入培养基中的假菌丝，由伸长的芽生孢子形成 白色念珠菌 丝状菌落 为多细胞真菌的菌落，由许多管状、分枝菌丝体组成 绒毛状、絮状、粉末状、颗粒状、石膏状。 可产生各种色素。 毛癣菌

（三）变异性 真菌易发生变异，在人工培养基中多次传代或孵育过久，可出现形态结构、菌落性状、色素及毒力等改变。

（四）抵抗力 真菌对干燥、阳光、紫外线及一般化学消毒剂有一定的耐受力，但充分暴露于阳光，紫外线及干燥情况下大多数真菌可被杀死，且对2.5%碘酒，10%福尔马林都敏感，一般可用福尔马林薰蒸被真菌感染的房间。 对热敏感，一般60℃1小时可杀死真菌菌丝和孢子。

二、致病性与免疫性 （一）致病性 真菌引起的疾病大致包括 真菌性感染：主要是外源性感染 浅部真菌侵犯皮肤、指甲及须发等组织，顽强繁殖，发生机械刺激损害，同时产生酶及酸等代谢产物，引起炎症反应和细胞病变。 深部真菌侵犯皮下，内脏及脑膜等处，引起慢性肉芽肿及坏死。 2．条件致病性真菌感染： 主要是内源性感染（如白色念珠菌），亦有外源性感染（如曲霉菌）。

侵犯害肝、肾、脑、中枢神经系统及造血组织。如黄曲霉毒素、某些镰刀菌素和黑葡萄穗素。 3．过敏性真菌病： 由真菌性过敏原（如孢子抗原）引起过敏症，如哮喘，变态反 应性肺泡炎和癣菌疹等。 4．真菌毒素中毒症： 侵犯害肝、肾、脑、中枢神经系统及造血组织。如黄曲霉毒素、某些镰刀菌素和黑葡萄穗素。

（二）免疫性 1．非特异性免疫：人类对真菌感染有天然免疫力。皮肤分泌短链脂肪酸和乳酸、血液中转铁蛋白、中性粒细胞和单核巨噬细胞的吞噬作用，以及正常菌群的拮抗作用。 2．特异性免疫：真菌感染中细胞免疫是机体排菌杀菌及复原的关键，T细胞分泌的淋巴因子、以T细胞为主导的迟发型变态反应引起免疫病理损伤能局限和消灭真菌，以终止感染。

三、微生物学诊断 （一） 直接检查 1．不染色标本的直接镜检： 1）标本制备： 2）检查方法： 3）封固液： 三、微生物学诊断 （一）   直接检查 1．不染色标本的直接镜检： 直接采取标本制片、显微镜下直接观察，若发现真菌菌丝或孢子存在时，即可初步判定为真菌感染。 1）标本制备： 2）检查方法： 3）封固液：

①KOH溶液：本液适于检查致密的难以透明的材料（如毛发、指甲、鳞屑等）。 ②墨汁：主要用于检查有荚膜的真菌（如新型隐球菌等） ③水合氯醛－石炭酸－乳酸封固液：此液透明力较强，只限于不透明的标本。 ④生理盐水：为观察真菌的出芽现象可用生理盐水代替氢氧化钾溶液。

3）糖原染色：菌体均染成红色。用于标本直接涂片及组织病理切片染色。 2．染色标本检查： 1）革兰氏染色： 各种真菌均为革兰氏阳性，为深蓝色。常用于酵母菌、白色念珠菌、孢子丝菌、诺卡菌及组织胞浆菌等。 2）乳酸酚棉蓝染色 3）糖原染色：菌体均染成红色。用于标本直接涂片及组织病理切片染色。 4）嗜银染色（GMS）：染成黑色。

5）粘蛋白卡红染色法（MCS）： 6）荧光染色： 主要使用吖啶橙和氢氧化钾来染直接涂片、培养涂片及组织切片。 主要用于新型隐球菌荚膜的染色。隐球菌荚膜和细胞壁呈红色，细胞核呈黑色。 6）荧光染色： 主要使用吖啶橙和氢氧化钾来染直接涂片、培养涂片及组织切片。

（二）培养检查 本法可确定菌种，辅助直接检查的不足； 通常用沙保氏培养基（SDA）（22～28℃）； 深部真菌可用血琼脂或脑心葡萄糖血琼脂37℃培养；

（三）免疫学试验 用于检测深部感染真菌的抗体，作为辅助诊断组织胞浆菌、念珠菌、曲霉菌。 检测深部感染真菌的抗原，用于早期、快速、特异的诊断。 乳胶凝集法检测新型隐球菌病患者的荚膜多糖抗原 ELISA法检测白色念珠菌感染者的甘露聚糖抗原 免疫荧光法检测孢子丝菌病患者的可溶性抗原

四、防治原则 真菌感染尚无特异预防，主要注意公共卫生和个人卫生； 碘化物治疗孢子丝菌病、毛霉菌病有一定疗效； 制霉素、灰黄霉素、克霉唑（三苯甲霉唑）等外用或内服对癣症和白色念珠菌病等有较好疗效； 近年报道5-氟胞嘧啶（5-FC）治疗单细胞真菌感染疗效显著； 二性霉素B可用于深部全身真菌感染。

第二部分　浅部真菌 浅部真菌主要为皮肤丝状菌（Dermatophytes），侵犯皮肤、毛发、指甲等角化组织引起癣症，又称癣菌(Ringworm)，分为三属，共37个种。

(一)、生物学特征 皮肤癣菌的特征 属名 种数 侵犯部位 形态特征 皮肤 指甲 毛发 大分生孢子 小分生孢子 菌 丝 毛癣 菌属 21 + 菌 丝 毛癣 菌属 21 + 细长、棒形、壁薄， 少见或无 梨形、棒形， 较多见 螺旋状、鹿角状、结节状、球拍状、破梳状，单纯细菌丝 小孢子癣菌属 15 - 纺锤形，壁较厚， 棒形，卵圆形， 较少见 球拍状及破梳状菌丝 表皮癣菌属 1 － 梨形、壁较薄， 多见 无 单纯菌丝

（二）检验方法： 1．直接镜检：直接采取病变部位的标本，用显微镜检查有无菌丝及孢子的存在，本法迅速简便，是临床真菌检查最常用的方法

2．分离培养： 取毛发、皮屑、甲屑等标本，用70％乙醇消毒，接种沙保氏琼脂斜面培养基，25℃培养7～14天，根据菌落形态及颜色、并挑取菌落镜检菌丝及孢子的特征进行鉴定。

毛癣菌属

小孢子菌属

表皮癣菌属

3．荧光检查：本法主要用于头癣检查。病发在滤过紫外灯照射下可发出不同色泽的荧光，如黄癣菌病发呈暗绿色荧光，白癣小孢子菌属的病发呈亮绿色荧光等。

第三部分　深部感染真菌 深部真菌是侵犯皮下组织和内脏，引起全身性感染的真菌。 多数能引起慢性肉芽肿样炎症、溃疡及坏死等病变

深部感染真菌分两大类： 1. 致病性真菌： 此类真菌在正常人体内部不存在，一旦侵入机体，即可致病，如组织胞浆菌、球孢子菌、芽生菌等，属外源性，我国少见； 2. 条件致病性真菌： 是人体正常菌群的成员，当机体抵抗力下降时才致病，如新型隐球菌、白色念珠菌、曲霉菌和毛霉菌等。

一、白色念珠菌 白色念珠菌（canidia Albicans）又称白色假丝酵母菌，广泛存在于自然界，也存在于正常人口腔，上呼吸道，肠道及阴道，一般在正常机体中数量少，不引起疾病 。 为条件致病性真菌。

（一）生物学特性 卵圆形，大小2μm×4μm，革兰氏染色阳性。 有假菌丝。

培养特性：典型类酵母型菌落，表面光滑，呈灰白色或奶油色，有酵母气味。 涂片镜检，可看到表层为卵圆形芽生细胞，底层有较多假菌丝。

（二）致病性和免疫性 白色念珠菌可侵犯人体许多部位，可引起： 机体可产生一定免疫力。 1. 皮肤念珠菌病：好发于皮肤皱褶处； 2. 粘膜念珠菌病：鹅口疮、口角炎、阴道炎最多见。 3. 内脏及中枢神经念珠菌病：肺炎、肠胃炎、心内膜炎、脑膜炎、脑炎等。 机体可产生一定免疫力。

（三）检验方法及鉴定 1．直接镜检：革兰氏染色镜检 2．培养特点：典型的酵母菌落。

3．鉴定试验 1）芽管试验：取少许待检的白色念珠菌接种于0.5ml人或兔血清中，混匀，直37℃水浴2-3h后，取出一接种环菌液，涂片、镜检。有芽管产生者为白色念珠菌，其他念珠菌不产生芽管。

2）TZC试验：将白色念珠菌接种于含0.005％氯化三本四氮唑的沙保培养基中，经22～25℃，24～48h培养， 白色念珠菌不变色或仅淡红色，其他念珠菌或酵母菌呈红色或深红色。 3）糖发酵和糖同化试验： 根据这两种试验可将常见的几种念珠菌进行鉴别。

4）动物实验： 本菌对兔有致病力。给兔耳静脉注射本菌，经4～5天死亡。解剖可见肾、肝肿胀、充血，并有小脓肿，涂片及培养均可见本菌及其假菌丝存在。 5）厚膜孢子形成试验： 本试验亦是鉴定白色念珠菌的重要方法之一，在玉米粉聚山梨酯－80琼脂培养基培养本菌，镜检观察到厚膜孢子及假菌丝。

4．血清学诊断 用于诊断全身性念珠菌病。以念珠菌为抗原测定机体抗念珠菌抗体

二、新型隐球菌 新型隐球菌又名溶组织酵母菌，是土壤，鸽类，牛乳、水果等的腐生菌，也可存在人口腔中。 可侵犯人和动物，一般为外源性感染，但也可能为内源性感染，对人类而言，它通常是条件致病菌。

（一）生物学特性 较大球形，直径可达5～20um， 有肥厚的荚膜，折光性强，一般染料不易着色，难以发现，称隐球菌， 用墨汁阴性显影法镜检 ，可见到透明荚膜包裹着菌细胞， 菌细胞常有出芽，但不生成假菌丝。

在沙保氏琼脂及血琼脂培养基上，于25及37℃皆可生长，而非病原性隐球菌在37℃不能繁殖。 酵母型菌落，呈白色。 本菌能分解尿素，以此与酵母菌和念珠菌鉴别。

（二）致病性 本菌大多由呼吸道转入，在肺部引起轻度炎症，或隐性传染。 侵犯中枢神经系统，发生脑膜炎、脑炎、脑肉芽肿等。 此外可侵入骨骼、肌肉、淋巴结、皮肤粘膜引起慢性炎症和脓肿。

（三）微生物学检验 1．直接镜检：常用墨汁涂片法。 2．分离培养： 在沙保培养基上，室温、37℃2～3天即可长出典型 酵母型菌落。有荚膜者菌落粘稠。

3．糖同化及发酵试验：本菌不发酵各种糖类，但能同化葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、半乳糖、肌醇，不同化乳糖。 4．酚氧化酶试验：在含Ｌ－多巴橘橼酸铁和咖啡酸培养基中，经２～５天培养，新型隐球菌出现棕黑色菌落。 ５．尿素酶试验：新型隐球菌产生尿素酶，在尿素培养基（含尿素及酚红指示剂）中分解尿素形成氨和CO2，以致培养基的pH值升高，使酚红由黄变为粉红色为阳性，而白色念珠菌为阴性。

谢　谢