医学检验系临床微生物及免疫学教研室 井申荣

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医学检验系临床微生物及免疫学教研室 井申荣 第二节 病原性真菌检验 医学检验系临床微生物及免疫学教研室 井申荣

第一部分 病原性真菌概述 真菌(Fungus) 具有典型细胞结构(细胞核、细胞器、细胞壁) 细胞壁含几丁质和(或)纤维素 第一部分 病原性真菌概述 真菌(Fungus) 具有典型细胞结构(细胞核、细胞器、细胞壁) 细胞壁含几丁质和(或)纤维素 无根、茎、叶,不含叶绿素 以腐生或寄生方式摄取养料 能进行有性生殖和(或)无性繁殖

对人类致病的真菌分为: 浅部真菌:侵犯皮肤、毛发、指甲,为慢性,对        治疗有顽固性,但影响身体较小, 深部真菌:可侵犯全身内脏,严重的可引起死亡。   此外有些真菌寄生于粮食、饲料、食品中,能产生毒素引起中毒性真菌病。

一、生物学性状 (一)形态结构 真菌细胞结构比细菌复杂 细胞壁为几丁质(Chitin)(多聚N-乙酰葡萄糖组成),并含葡聚糖,甘露聚糖及蛋白质,某些酵母菌还含类脂体。 细胞内有较为典型的核结构和细胞器。

真菌形态分单细胞和多细胞两类 单细胞真菌主要为酵母和类酵母菌(如隐球菌、念珠菌),呈圆形或椭圆形。以出芽方式繁殖。 多细胞真菌由菌丝和孢子组成 菌丝分枝交织成团,形成菌丝体(Mycelium),并长有各种孢子,这类真菌即一般称为霉菌(Mold)。 由于生活环境(如营养、温度、氧气等)的改变,有些真菌的孢子与菌丝两种形态可以互变,这类真菌称为二相性真菌(dimorphic fungus),如球孢子菌、组织胞浆菌及芽生菌。

真菌孢子和细菌芽胞的区别 真菌孢子 细菌芽胞 抵抗力 不强,60-70短时间杀死 强,煮沸短时间不死 数目 一条菌丝可产生多个孢子 一个细菌体只形成一个芽孢 作用 为繁殖方式之一 不是繁殖方式 形成位置 可在细胞内外形成 只在细菌细胞内形成 形状 形态、色泽多样 圆形或椭圆形

真菌的形态构成 菌 丝 营养菌丝 气生菌丝→ 生殖菌丝 孢 子 有性孢子 由同一菌体或不同菌体上的二个细胞融合形成 菌 丝 营养菌丝 气生菌丝→ 生殖菌丝 孢 子 有性孢子 由同一菌体或不同菌体上的二个细胞融合形成 绝大多数属于非致病性真菌所具有 无 性 孢 子 分生孢子 分生孢子梗的顶端或侧面 大分生孢子 小孢子菌属、 表皮癣菌属 小分生孢子 毛癣菌属 叶状孢子 菌丝细胞直接形成 芽生孢子 隐球菌、念珠菌 关节孢子 厚膜孢子 新型隐球菌 子囊孢子 菌丝末端形成膨大的囊状结构即孢子囊,内含很多孢子 根霉菌

真菌菌丝形态

真菌孢子形态

(二)培养特性 大多数真菌营养要求不高,常用沙保氏培养基 (SDA)培养。 浅部病原性真菌的最适温度为22~28℃,生长缓慢,大多于1~4周出现典型菌落。 深部病原性真菌培养在37℃中生长最好,生长较快,经3-4天即长出菌落。

真菌菌落类型 类型 定义 特征 颜色 举例 酵母型菌落 为单细胞真菌的菌落,形态与一般细菌菌落相似,以出芽形式繁殖 光滑、湿润, 一般为乳白色 新型隐珠菌 类酵母型菌落 外观似酵母菌落,但可见伸入培养基中的假菌丝,由伸长的芽生孢子形成 白色念珠菌 丝状菌落 为多细胞真菌的菌落,由许多管状、分枝菌丝体组成 绒毛状、絮状、粉末状、颗粒状、石膏状。 可产生各种色素。 毛癣菌

(三)变异性 真菌易发生变异,在人工培养基中多次传代或孵育过久,可出现形态结构、菌落性状、色素及毒力等改变。

(四)抵抗力 真菌对干燥、阳光、紫外线及一般化学消毒剂有一定的耐受力,但充分暴露于阳光,紫外线及干燥情况下大多数真菌可被杀死,且对2.5%碘酒,10%福尔马林都敏感,一般可用福尔马林薰蒸被真菌感染的房间。 对热敏感,一般60℃1小时可杀死真菌菌丝和孢子。

二、致病性与免疫性 (一)致病性 真菌引起的疾病大致包括 真菌性感染:主要是外源性感染 浅部真菌侵犯皮肤、指甲及须发等组织,顽强繁殖,发生机械刺激损害,同时产生酶及酸等代谢产物,引起炎症反应和细胞病变。 深部真菌侵犯皮下,内脏及脑膜等处,引起慢性肉芽肿及坏死。 2.条件致病性真菌感染: 主要是内源性感染(如白色念珠菌),亦有外源性感染(如曲霉菌)。

侵犯害肝、肾、脑、中枢神经系统及造血组织。如黄曲霉毒素、某些镰刀菌素和黑葡萄穗素。 3.过敏性真菌病: 由真菌性过敏原(如孢子抗原)引起过敏症,如哮喘,变态反 应性肺泡炎和癣菌疹等。 4.真菌毒素中毒症: 侵犯害肝、肾、脑、中枢神经系统及造血组织。如黄曲霉毒素、某些镰刀菌素和黑葡萄穗素。

(二)免疫性 1.非特异性免疫:人类对真菌感染有天然免疫力。皮肤分泌短链脂肪酸和乳酸、血液中转铁蛋白、中性粒细胞和单核巨噬细胞的吞噬作用,以及正常菌群的拮抗作用。 2.特异性免疫:真菌感染中细胞免疫是机体排菌杀菌及复原的关键,T细胞分泌的淋巴因子、以T细胞为主导的迟发型变态反应引起免疫病理损伤能局限和消灭真菌,以终止感染。

三、微生物学诊断 (一) 直接检查 1.不染色标本的直接镜检: 1)标本制备: 2)检查方法: 3)封固液: 三、微生物学诊断 (一)   直接检查 1.不染色标本的直接镜检: 直接采取标本制片、显微镜下直接观察,若发现真菌菌丝或孢子存在时,即可初步判定为真菌感染。 1)标本制备: 2)检查方法: 3)封固液:

①KOH溶液:本液适于检查致密的难以透明的材料(如毛发、指甲、鳞屑等)。 ②墨汁:主要用于检查有荚膜的真菌(如新型隐球菌等) ③水合氯醛-石炭酸-乳酸封固液:此液透明力较强,只限于不透明的标本。 ④生理盐水:为观察真菌的出芽现象可用生理盐水代替氢氧化钾溶液。

3)糖原染色:菌体均染成红色。用于标本直接涂片及组织病理切片染色。 2.染色标本检查: 1)革兰氏染色: 各种真菌均为革兰氏阳性,为深蓝色。常用于酵母菌、白色念珠菌、孢子丝菌、诺卡菌及组织胞浆菌等。 2)乳酸酚棉蓝染色 3)糖原染色:菌体均染成红色。用于标本直接涂片及组织病理切片染色。 4)嗜银染色(GMS):染成黑色。

5)粘蛋白卡红染色法(MCS): 6)荧光染色: 主要使用吖啶橙和氢氧化钾来染直接涂片、培养涂片及组织切片。 主要用于新型隐球菌荚膜的染色。隐球菌荚膜和细胞壁呈红色,细胞核呈黑色。 6)荧光染色: 主要使用吖啶橙和氢氧化钾来染直接涂片、培养涂片及组织切片。

(二)培养检查 本法可确定菌种,辅助直接检查的不足; 通常用沙保氏培养基(SDA)(22~28℃); 深部真菌可用血琼脂或脑心葡萄糖血琼脂37℃培养;

(三)免疫学试验 用于检测深部感染真菌的抗体,作为辅助诊断组织胞浆菌、念珠菌、曲霉菌。 检测深部感染真菌的抗原,用于早期、快速、特异的诊断。 乳胶凝集法检测新型隐球菌病患者的荚膜多糖抗原 ELISA法检测白色念珠菌感染者的甘露聚糖抗原 免疫荧光法检测孢子丝菌病患者的可溶性抗原

四、防治原则 真菌感染尚无特异预防,主要注意公共卫生和个人卫生; 碘化物治疗孢子丝菌病、毛霉菌病有一定疗效; 制霉素、灰黄霉素、克霉唑(三苯甲霉唑)等外用或内服对癣症和白色念珠菌病等有较好疗效; 近年报道5-氟胞嘧啶(5-FC)治疗单细胞真菌感染疗效显著; 二性霉素B可用于深部全身真菌感染。

第二部分 浅部真菌 浅部真菌主要为皮肤丝状菌(Dermatophytes),侵犯皮肤、毛发、指甲等角化组织引起癣症,又称癣菌(Ringworm),分为三属,共37个种。

(一)、生物学特征 皮肤癣菌的特征 属名 种数 侵犯部位 形态特征 皮肤 指甲 毛发 大分生孢子 小分生孢子 菌 丝 毛癣 菌属 21 + 菌 丝 毛癣 菌属 21 + 细长、棒形、壁薄, 少见或无 梨形、棒形, 较多见 螺旋状、鹿角状、结节状、球拍状、破梳状,单纯细菌丝 小孢子癣菌属 15 - 纺锤形,壁较厚, 棒形,卵圆形, 较少见 球拍状及破梳状菌丝 表皮癣菌属 1 - 梨形、壁较薄, 多见 无 单纯菌丝

(二)检验方法: 1.直接镜检:直接采取病变部位的标本,用显微镜检查有无菌丝及孢子的存在,本法迅速简便,是临床真菌检查最常用的方法

2.分离培养: 取毛发、皮屑、甲屑等标本,用70%乙醇消毒,接种沙保氏琼脂斜面培养基,25℃培养7~14天,根据菌落形态及颜色、并挑取菌落镜检菌丝及孢子的特征进行鉴定。

毛癣菌属

小孢子菌属

表皮癣菌属

3.荧光检查:本法主要用于头癣检查。病发在滤过紫外灯照射下可发出不同色泽的荧光,如黄癣菌病发呈暗绿色荧光,白癣小孢子菌属的病发呈亮绿色荧光等。

第三部分 深部感染真菌 深部真菌是侵犯皮下组织和内脏,引起全身性感染的真菌。 多数能引起慢性肉芽肿样炎症、溃疡及坏死等病变

深部感染真菌分两大类: 1. 致病性真菌: 此类真菌在正常人体内部不存在,一旦侵入机体,即可致病,如组织胞浆菌、球孢子菌、芽生菌等,属外源性,我国少见; 2. 条件致病性真菌: 是人体正常菌群的成员,当机体抵抗力下降时才致病,如新型隐球菌、白色念珠菌、曲霉菌和毛霉菌等。

一、白色念珠菌 白色念珠菌(canidia Albicans)又称白色假丝酵母菌,广泛存在于自然界,也存在于正常人口腔,上呼吸道,肠道及阴道,一般在正常机体中数量少,不引起疾病 。 为条件致病性真菌。

(一)生物学特性 卵圆形,大小2μm×4μm,革兰氏染色阳性。 有假菌丝。

培养特性:典型类酵母型菌落,表面光滑,呈灰白色或奶油色,有酵母气味。 涂片镜检,可看到表层为卵圆形芽生细胞,底层有较多假菌丝。

(二)致病性和免疫性 白色念珠菌可侵犯人体许多部位,可引起: 机体可产生一定免疫力。 1. 皮肤念珠菌病:好发于皮肤皱褶处; 2. 粘膜念珠菌病:鹅口疮、口角炎、阴道炎最多见。 3. 内脏及中枢神经念珠菌病:肺炎、肠胃炎、心内膜炎、脑膜炎、脑炎等。 机体可产生一定免疫力。

(三)检验方法及鉴定 1.直接镜检:革兰氏染色镜检 2.培养特点:典型的酵母菌落。

3.鉴定试验 1)芽管试验:取少许待检的白色念珠菌接种于0.5ml人或兔血清中,混匀,直37℃水浴2-3h后,取出一接种环菌液,涂片、镜检。有芽管产生者为白色念珠菌,其他念珠菌不产生芽管。

2)TZC试验:将白色念珠菌接种于含0.005%氯化三本四氮唑的沙保培养基中,经22~25℃,24~48h培养, 白色念珠菌不变色或仅淡红色,其他念珠菌或酵母菌呈红色或深红色。 3)糖发酵和糖同化试验: 根据这两种试验可将常见的几种念珠菌进行鉴别。

4)动物实验: 本菌对兔有致病力。给兔耳静脉注射本菌,经4~5天死亡。解剖可见肾、肝肿胀、充血,并有小脓肿,涂片及培养均可见本菌及其假菌丝存在。 5)厚膜孢子形成试验: 本试验亦是鉴定白色念珠菌的重要方法之一,在玉米粉聚山梨酯-80琼脂培养基培养本菌,镜检观察到厚膜孢子及假菌丝。

4.血清学诊断 用于诊断全身性念珠菌病。以念珠菌为抗原测定机体抗念珠菌抗体

二、新型隐球菌 新型隐球菌又名溶组织酵母菌,是土壤,鸽类,牛乳、水果等的腐生菌,也可存在人口腔中。 可侵犯人和动物,一般为外源性感染,但也可能为内源性感染,对人类而言,它通常是条件致病菌。

(一)生物学特性 较大球形,直径可达5~20um, 有肥厚的荚膜,折光性强,一般染料不易着色,难以发现,称隐球菌, 用墨汁阴性显影法镜检 ,可见到透明荚膜包裹着菌细胞, 菌细胞常有出芽,但不生成假菌丝。

在沙保氏琼脂及血琼脂培养基上,于25及37℃皆可生长,而非病原性隐球菌在37℃不能繁殖。 酵母型菌落,呈白色。 本菌能分解尿素,以此与酵母菌和念珠菌鉴别。

(二)致病性 本菌大多由呼吸道转入,在肺部引起轻度炎症,或隐性传染。 侵犯中枢神经系统,发生脑膜炎、脑炎、脑肉芽肿等。 此外可侵入骨骼、肌肉、淋巴结、皮肤粘膜引起慢性炎症和脓肿。

(三)微生物学检验 1.直接镜检:常用墨汁涂片法。 2.分离培养: 在沙保培养基上,室温、37℃2~3天即可长出典型 酵母型菌落。有荚膜者菌落粘稠。

3.糖同化及发酵试验:本菌不发酵各种糖类,但能同化葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、半乳糖、肌醇,不同化乳糖。 4.酚氧化酶试验:在含L-多巴橘橼酸铁和咖啡酸培养基中,经2~5天培养,新型隐球菌出现棕黑色菌落。 5.尿素酶试验:新型隐球菌产生尿素酶,在尿素培养基(含尿素及酚红指示剂)中分解尿素形成氨和CO2,以致培养基的pH值升高,使酚红由黄变为粉红色为阳性,而白色念珠菌为阴性。

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