实验九 微生物的生理生化特性 实验目的 实验用具 培养基及染色试剂 水样的采集和保存 实验方法及步骤 思考题

一、实验目的 在水处理工程中，水源水要经过处理后才能供给用户。饮用水要求清澈、无色、无臭，更重要的是没有病原菌。因此，自来水在出厂以前要作水质的物理化学分析和细菌检验，本实验结合给水净化工程中的细菌检验，作细菌总数和大肠菌群的测定。通过大肠菌群的测定，了解大肠杆菌的生理生化特性。 大肠菌群数系指每升水样中所含有的大肠菌群的数目。大肠菌数一般包括大肠埃希氏杆菌、产气杆菌、枸椽酸盐杆菌和副大肠杆菌。本实验的发酵试验采用含有乳糖的培养基，故测定结果不包括副大肠杆菌。 细菌总数是指1mL水样在营养琼脂培养基中，于37°C经24h培养后，所生长的细菌菌落的总数(实际上所表示的是腐生细菌的数目。腐生细菌在营养琼脂培养基上所形成的菌落呈白色细点状)。 我国现行生活饮用水卫生标准GB5749—85规定：细菌总数是指1mL水中不得超过100个，大肠菌群1L水中不得超过3个。

二、实验用具 1．水样瓶； 2．吸管、试管、锥形瓶等；3．稀释瓶； 4．培养皿(平皿)； 5．发酵管和发酵瓶； 6．接种环； 7．细菌滤器； 8．滤膜； 9．高压蒸汽灭菌器； l0．恒温箱(培养箱)； 11．电冰箱； 12．显微镜； 13．镜油(香柏油)、二甲苯、擦镜纸等； 14．普通放大镜； 15．pH电位计(或氢离子浓度比色计或pH精密试纸)。

三、培养基及染色试剂 本实验所需培养基及染色试剂有如下几种： 1、营养琼脂培养基：供细菌总数测定用 2、乳糖蛋白胨培养基：供大肠菌群检验“发酵法”用 3、浓乳糖蛋白胨培养基：供大肠菌群检验“发酵法”用 4、伊红美蓝培养基：供大肠菌群检验“发酵法”用 5、革兰氏染色剂：供大肠菌群检验用

四、水样的采集和保存 用于细菌检验之水样较化学分析所用的尤应谨慎采取。所取水样必须要保证其代表性。并在收集和保存时不得有所污染，瓶中水样不应完全装满，以便于检验前能彻底摇匀。采集水样的容器，可用清洁硬质玻璃瓶。容器必须经高压灭菌，保证无菌。并需保证水样在运送、保存过程中不受污染。 如要从河湖或井水中取水，可用特制的采样器。取样前应对玻璃瓶先作灭菌处理。采集时将采样器浸入水中，使采样瓶口位于水面下10-15cm深处。然后拉开瓶塞，使水进入瓶中。水样采集后，应将水样瓶中水样倒入无菌储样玻璃瓶中，或将水样瓶取出，立即用无菌棉塞塞好瓶口，以备检查。

采取自来水水样时，须先冲洗龙头，再用酒精棉烧灼灭菌，然后放水5-10min，接着将瓶移上取水。 采取含有余氯的水样时，应在水样瓶未检验前接500mL水样加入1.5％硫代硫酸钠溶液2mL，以消除氯的作用。 水样采集和分析的间隔时间应尽可能缩短。水样采取与检验相隔时间应在4h内。 取样时要将取样日期、温度、水的来源、环境状况、水的用途等注明。

五、实验方法及步骤 (一)大肠菌群的检验（水源水，发酵法） 原理：发酵法是根据大肠菌群能发酵某些糖类而产酸产气等特性来进行检验的。 步骤：(1)水样稀释 (2)初发酵试验: 以无菌操作的方法，用无菌移液管吸取1mL1:100和l:10的稀释水样以及1mL原水样，分别注入装有10mL乳糖蛋白胨培养基的发酵管中，另取10mL原水样，注入装有5mL三倍浓乳糖蛋白胨培养基的发酵管中，置37℃恒温箱中培养18-24h后观察结果。 情况分析：①如无气体和酸产生，则为阴性反应，表示无大肠菌群存在；②如有气体和酸产生，或虽无气体产生，但有酸形成，则为阳性反应，表示此水可能为粪便污染，需作进一步的检验；③如有气体形成，但没有产酸，溶液也不浑浊，则操作技术上有问题，须重作检验。

(3)平板分离：用无菌接种环，从前一阶段所需进一步检验的发酵管中沾取菌液，在伊红美蓝培养基上划线。然后将培养皿置于37℃恒温箱内培养18-24h，记录其结果如下： 1)如无细菌增殖现象，可认为是阴性反应，无大肠菌群存在。 2)如仅发现芒状、霉状或其它无关菌属的菌落，则表示无粪便性的污染。 3)如发现有下列特征的菌落，则应取菌落的一小部分进行涂片、革兰氏染色、镜检。如涂片中没有革兰氏阴性的杆菌，则表示无大肠菌群存在；如涂片中有革兰氏阴性无芽孢的杆菌时，则进行复发酵试验。

(4)复发酵试验：用无菌接种环挑取上述涂片镜检显示革兰氏阴性无芽孢杆菌的菌落的另一部分接种于已灭菌的装有10mL普通浓度乳糖蛋白胨培养基的小发酵管(内有倒管)中，每管可接种分离自同一初发酵管或发酵瓶的最典型的菌落1-3个，然后置于37℃恒温箱中培养18-24h，有产酸产气者(不论倒管内气体多少皆作为产气论)，即证实大肠菌群存在。

大肠菌群的检验步骤方框图： 阳性管 大肠菌群 厌氧芽孢杆菌 好氧芽孢杆菌 初步发酵 产酸产气 水样接种 产生 典型菌落 鉴别培养基 平板分离 复发酵 大肠菌群 革兰氏阴性无芽孢 革兰氏染色 大肠菌群 好氧芽孢杆菌 阳性管

倾倒法 (二)细菌总数的测定 （水源水，倾倒法） 原理：本试验采用标准平皿法对水样中细菌作计数，这是测定水中好氧和兼性厌氧异养细菌密度的方法。由于细菌在水体个能以单独个体、成对、链状、成簇或成团的形式存在，此外没有单独的一种培养基或其一环境条件能满足一个水样中所有细菌的生理要求，所以由此法所得的菌落数实际上要低于被测水样中真正存在的活细菌的数目。 制作培养基平板 定量接种水样 37℃下培养18－24h 倾倒法 计数菌落

步骤：(1)水样稀释。(2)根据水样的洁净程度，污染严重者选取10-2、10-3、10-4三个连续稀释度，中等的选取10-1、10-2、10-3三个连续稀释度。稀释度的选择是本试验精确度的关键，选择适宜者，平皿上菌落总数介于30和300之间。(3)吸取由高倍至低倍的稀释液，每个稀释液分别注入两个培养皿，每皿1mL。注入彻底融化，然后冷却到45℃的营养琼脂培养基约15mL，立即旋摇培养皿，充分混匀。方法是握住平皿，先往一个方向画圆，再朝相反方向回转；或一面画圆，一面适当倾斜。小心勿使这个混合液体溅到培养皿的边缘。让平皿培养基于水平位置放置至固化后倒置于37℃生化箱中培养18-24h，观察结果。

菌落计数及报告方法：作平皿菌落计数时，可用眼睛直接观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平皿的菌落数后，应求出同稀释度的平均菌落数，供下一步计算时应用。在求同稀释度的平均数时，若其中一个平皿有较大片状菌落生长时，则不宜采用。而应以无片状菌落生长的平皿作为该稀释度的平均菌落数。若片状菌落不到平皿的一半，而其余一半中菌落数分布又很均匀。则可将此平皿计数后乘 2 以代表全皿菌落数。

各种不同情况的计算方法 ： (1)首先选择平均菌群数在30-300之间者进行计算。当只有一个稀释度的平均菌落符合此范围时，则即以该平均菌落数乘其稀释倍数报告之。 (2)若有两个稀释度，其平均菌落数均在30-300之间，则应按两者菌落总数之比值来决定。若其比值小于2应报告两者的平均数，若大于2则报告其中较小的菌落总数。 (3)若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。 (4)若所有稀释度的平均菌落数均小于300，则应按稀释度最低的平均茵落数乘以稀释倍数报告之。 (5)若所有稀释度的平均菌落数均不在30-300之间，则以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。

六、思考题 1、测定大肠菌群数说明什么问题？为什么要用 大肠菌群作检验指标? 2、测定细菌总数说明些什么? 1、测定大肠菌群数说明什么问题？为什么要用 大肠菌群作检验指标? 2、测定细菌总数说明些什么? 3、为什么乳糖蛋白胨培养基用0.7kg/cm2 灭菌，而不用1kg/cm2 20miｎ？ 4、作了细菌检验，为什么自来水厂还要经常进行余氯的测定? 5、根据我国饮用水水质标准，讨论这次检验的结果？

谢 谢