实验十一 大肠杆菌的转化
目的与要求 学习分子遗传学的基本操作。 了解质粒在遗传工程中的重要作用及转化子的筛选方法。
实验原理 所谓转化是指细菌细胞从外界环境中吸收含有某些基因的DNA片段,从而表现出相应性状的现象。细菌细胞不是任何状态下都能吸收外源DNA。它只有处于一种易于接受外源DNA的状态——感受态(competence)时才具备这种能力。分子生物学研究中,利用最多的大肠杆菌,感受态则必须通过物理的或化学的方法进行诱导。
实验原理 通常的做法是在大肠杆菌对数生长的早中期,在0度条件下用CaCl2处理细胞,并辅之以短时间的热激。感受态细胞吸收DNA的极力尚未明确。天然的转化体系与CaCl2诱发的转化体系有一个很重要的差异:前者需要线性的DNA片段;而后者更多的是吸收环状的DNA。这样我们可以把外源基因连接在质粒DNA上导入到大肠杆菌中。这样,外源DNA不需要与宿主染色体重组,即可随着质粒独立的复制,并表达相应的性状。
实验材料和用品 材料:大肠杆菌 质粒DNA(自己提取) 用品:不加氨卞的LB平板和加氨卞 (100ug/ml)的LB平板 超净工作台 恒温摇床 低温离心机 0.1mol/L CaCl2
实验步骤 分3天进行: 第一天制备感受态细胞;(14-16小时) 第二天完成转化; 第三天观察结果。(16小时)
感受态细胞的制备及转化 取处于对数生长期的受体E.coli菌液1-1.5ml。 12000rpm离心30秒钟,弃上清,混匀沉淀物, 加预冷的0.1M CaCl2 1ml,混匀后12000rpm离心30秒钟,弃上清, 加300ul冷0.1M CaCl2及10ul质粒DNA混匀后,冰浴30分钟,
感受态细胞的制备及转化 42度处于90秒钟 立即冰浴1-2分钟后加800ul LB培养基 混匀后37度振荡培养50分钟 取100ul培养物涂布于含终浓度100ug/ml Amp的LB培养基上,37度培养16小时 次日上午8:00-10:00看转化结果
实验结果
计算转化率 转化率 =每质粒DNA所转化的大肠杆菌数x100% =菌落数/质粒DNA用量x100%
思考题 什么是转化?什么是转导?两者有什么区别? 在转化实验中。实验组和对照平皿应有什么样的结果?如何解释这个结果?