蚌埠医学院2005级毕业答辩 学 生：徐少华 人肝癌SMMC-7721/5-Fu耐药细胞株 多药耐药与凋亡关系的研究 专 业：生物科学 学 生：徐少华 专 业：生物科学 指导老师：刘辉 实习单位：蚌埠医学院生物科学系中心实验室

1 研究背景 2 研究内容 3 研究方法 4 研究结果 4 5 讨论与小结

肝癌细胞的多药耐药 研究背景 原发性肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，在我国其死亡率位于第二位，虽然新的抗肿瘤药物及化疗方案不断推出，但疗效仍不尽人意，造成这一现象的主要原因是肿瘤细胞对化疗药物产生了耐药性。 多药耐药是指肿瘤细胞对一种抗肿瘤药物出现抗药性的同时，对其他多种结构不同，作用靶位不同的抗肿瘤药物也有耐药性。 耐药是导致化疗失败、影响原发性肝癌治愈率和远期生存率的主要原因。因此，探寻药物的耐药机制，寻找有效的方法和制剂以逆转原发性肝癌耐药具有十分重要的意义。 本实验通过研究 人肝癌SMMC-7721细胞株，SMMC-7721/5-Fu耐药细胞株 对不同抗肿瘤药物的耐受分析； 细胞凋亡和细胞周期变化； 细胞凋亡相关基因bcl-2,bax,survivin的表达情况。 探讨 SMMC-7721/5-Fu的耐药机制及耐药与细胞凋亡的关系。 研究内容

研究方法 一、药物耐药性分析 RR= IC50（SMMC-7721/5-Fu）/IC50（SMMC-7721） SMMC-7721， SMMC-7721/5-Fu细胞株培养一定时间，加入不同浓度的5-Fu,甲氨蝶呤，每种药物7个等比稀释剂量组，继续培养48h。经过处理后用BIO-RAD Model 550酶标仪在波长490nm处测定OD值，使用bliss法求算各种药物对细胞50﹪ ，抑制率剂量（IC50），计算相对耐药度（relativeresistance，RR）： RR= IC50（SMMC-7721/5-Fu）/IC50（SMMC-7721） 二、流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期变化 对数生长期的SMMC-7721细胞及SMMC-7721/5-Fu细胞常规消化后，接种5×105 细胞于100cm2 培养瓶中，24h后，加入5-Fu，调整终浓度为0.5ug/ml及2.5ug/ml，继续培养48h。按Annexin-V 细胞凋亡检测试剂盒说明书操作。用流式细胞仪FACScan测定，经计算机软件处理，计算凋亡细胞的百分率。70﹪乙醇固定过夜，PI染色检测细胞周期的改变。

研究方法 三、RT-PCR分析细胞凋亡相关基因 bcl-2,bax,survivin的表达情况。 产物 正向引物 反向引物 片断大小（bp） 按TRIzol试剂盒（MBI公司）操作说明提取总RNA，用逆转录试剂盒合成第1链， PCR扩增细胞凋亡相关基因，以GAPDH为内对照，其引物序列为： Forward primer: 5′-AATCCCATCACCATCTTCCA-3′， Reverse primer:5′-CCTGCTTCACCACCTTCTTG-3′， 扩增片断大小为375bp 产物 正向引物 反向引物 片断大小（bp） Bcl-2 GCCTCCGTTATCCTGGATCC CAGCTGCACCTGACGCCCTT 231 bax TGTCCAGCCCATGATGGTTC ACCAAGAAGCTGATCGAGTGTC 258 survivin GGACCACCGCATCTCTACATTCC AGAAACACTGGGCCAAGTC 133

表2 SMMC-7721细胞和SMMC-7721/5-Fu细胞的耐药性分析 研究结果 一、SMMC-7721/5-Fu细胞多药耐药性的检测 　 与SMMC-7721细胞相比，SMMC-7721/5-Fu细胞除对5-Fu耐药外，对其他几种常用化疗药物均有不同程度的耐药性，对5-Fu、甲氨蝶呤的耐药倍数分别为102.0倍、20.6倍，见表2。 表2 SMMC-7721细胞和SMMC-7721/5-Fu细胞的耐药性分析 二、（1）SMMC-7721细胞和SMMC-7721/5-Fu细胞的周期分析 经0.5ug/ml和2.5ug/ml 5-Fu处理后，SMMC-7721细胞与其对照组相比，呈现明显的G0/G1期增加，S期、G2/M减少，而SMMC-7721/5-Fu细胞与其对照组相比细胞周期未见明显改变。 化疗药物 IC50μmol/L RR SMMC－7721 SMMC-7721/5-Fu 5-Fu 甲氨蝶呤 26±4 0.16±0.05 2985±384 3.3±0.8 102.0 20.6

研究结果 组别 AI（%） 二、（2）SMMC-7721和SMMC-7721/5-Fu细胞凋亡的检测 SMMC-7721组 以5-Fu对SMMC-7721细胞的IC50浓度（0.5ug/ml）及5×IC50浓度（2.5ug/ml）处理SMMC-7721和SMMC-7721/5-Fu细胞。结果显示，见表3。 表3 SMMC-7721细胞和SMMC-7721/5-Fu细胞在5-Fu作用下的凋亡分析 SMMC-7721细胞中 ，0.5ug/ml 5-Fu组和2.5ug/ml 5-Fu组与对照组相比，凋亡分别增加了1.4倍和2.3倍，差异具有显著性（P<0.05）。而经同样浓度5-Fu处理的SMMC-7721/5-Fu细胞中 ，0.5ug/ml 5-Fu组，2.5ug/ml 5-Fu组与其对照组相比，细胞凋亡变化不明显。 组别 AI（%） SMMC-7721组 0.5ug/ml 5-Fu处理SMMC-7721组 2.5ug/ml 5-Fu处理SMMC-7721组 SMMC-7721/5-Fu组 0.5 ug/ml 5-Fu处理SMMC-7721/5-Fu组 2.5 ug/ml 5-Fu处理SMMC-7721/5-Fu组 6.3±1.0 12.0±3.0 18.6±4.8 6.5±0.5 7.3±2.4 6.4±1.9

研究结果 三、SMMC-7721细胞和SMMC-7721/5-Fu细胞凋亡相关基因表达分析 PCR方法检测SMMC-7721和SMMC-7721/5-Fu细胞中bcl-2、bax 和survivin等凋亡相关基因在mRNA水平表达的变化情况。与SMMC-7721细胞相比，SMMC-7721/5-Fu细胞耐药株survivin和bax的表达增高。在人肝癌细胞SMMC-7721和SMMC-7721/5-Fu细胞mRNA水平bcl-2的表达皆很少，见图1。 图 1：SMMC－7721和SMMC-7721/5-Fu细胞中bcl-2、bax和survivin等凋亡相关基因表达凝胶电泳图。（注：1:SMMC-7721；2:SMMC-7721/5-Fu）

讨论与小结 导致肿瘤细胞发生多药耐药的机制复杂,除了MRP、TopoII 和GST/GSH 等耐药蛋白和酶的改变之外,细胞凋亡调控机制的紊乱也可使肿瘤细胞对多种化疗药物产生交叉耐药。 本研究以该细胞株为研究对象，使用Annexin V-FITC/PI双标流式细胞术检测凋亡，从凋亡的角度探讨其多药耐药的机制，发现使用SMMC-7721细胞IC50及5倍IC50剂量的5-Fu处理SMMC-7721细胞，其细胞凋亡数量明显增多；而用相同剂量的5-Fu处理SMMC-7721/5-Fu耐药细胞，其细胞凋亡数量没有明显的变化。 研究结果提示SMMC-7721/5-Fu细胞株多药耐药与该细胞株细胞的凋亡减少密切相关。 以上实验结果表明： 1.SMMC-7721/5-Fu多药耐药与肿瘤细胞的凋亡减少密切相关。 2.一些重要的凋亡相关因子如survivin,bax表达量的增高可能和肝癌细胞的多药耐药有关，特别是survivin表达量的增高。 3.不过凋亡相关因子哪些在肝癌的耐药中起了关键性的作用、它们之间的相互关系如何以及这些凋亡相关因子和跨膜蛋白如MRP等的关系如何，还有待进一步的实验来阐明。 4.survivin基因的突变与肝癌细胞的细胞周期的改变、耐药性的产生相关，是肝癌细胞SMMC-7721/5-Fu产生多药耐药性的机制之一。

致谢 首先感谢蚌埠医学院检验系生物化学与分子生物学教研室对本课题给予的资金项目资助（课题名称：生物技术综合实验课程体系的建设，资金项目号：安徽省省级教学研究项目2007jyxm328，项目负责人：陈昌杰副教授）。 感谢蚌埠医学院生物科学系刘辉老师，刘高峰老师，吴守伟老师，张鼎老师在实习生活中对我的帮助，在此表示衷心的感谢！ 感谢唐宝定老师,廖亚平老师，鲍明升老师，李蕾娜老师在实习生活以及考研过程中对我的关心和帮助，在此表示衷心的感谢！ 向所有关心支持我的老师同学们表示最真诚的谢意 ！