RNA i 及其应用实例 苏踊跃 suyy@mail.tmmu.com.cn 2006-10-18

“沉默”是金 2006 Nobel Prize 生理学（医学奖) RNA interference

后基因组研究焦点：基因功能研究 抑制基因表达 观察功能变化 Knock Out 法 Antisense法 Ribozyme法 RNAi法

概 念： RNA interference（RNAi） 与靶基因序列同源的双链RNA所诱导一种序列特异性的转录后基因沉默现象。

RNAi 发现历程： 1990年，曾有科学家给矮牵牛花插入一种催生红色素的基因，希望能够让花朵更鲜艳。但意想不到的事发生了：矮牵牛花完全褪色，花瓣变成了白色！ ? ?

1995年 康奈尔大学 Guo等在对线虫C.elegans的研究中，应用正义链RNA作为对照，研究par-1基因的表达，意外的发现，正义链RNA与反义链RNA同样能够抑制目的基因的表达。

Mex-3 mRNA detection in embryos by in situ hybridization 1998年，Andrew Fire等首次将正义链反义链RNA混合注入线虫C.elegans中，观察到更强的基因表达抑制。首次提出了RNA interference的概念。 A control: not stained B: wt C: wt + antisense RNA D: wt + ds RNA Mex-3 mRNA detection in embryos by in situ hybridization

RNAi机制 Dicer RISC 碱基互补 酶解

加工长链 dsRNA形成 21-23 nt 小片段 short-interfering RNA 34 27 21 20 16 Tuschl, 2001

Dicer contains two RNAse III domains long dsRNA siRNAs

RISC: RNA-Induced Silencing Complex 形成RISC复合物，降解目的mRNA Endonuclease Homology search activity 3’ Helicase 5’ Exonuclease RISC: RNA-Induced Silencing Complex Target mRNA OH3’ 5’P

RNAi 的生物学意义： 一种古老、保守而又及其重要的遗传学行为。生物体在长期的进化过程中对异常基因活动的监控和防御,有学者称之为“基因组水平的免疫系统”。 一种抗病毒感染机制。

与其他反基因技术的比较： 优点： 1、特异性好； 2、抑制效率高； 3、操作相对简单，实验周期短； 缺点： 1、靶点选择的不确定性； 2、核酸的不稳定性，dsRNA引入细胞的常见问题； 3、脱靶效应； 4、生物安全性（质粒，病毒等）。

RNAi 的应用： 功能基因组学 药物靶筛选和验证 细胞信号传导通路分析 基因治疗的新策略

基因治疗方面的应用 抗肿瘤策略—— 应用RNAi技术抑制肿瘤细胞（如肝癌细胞、胆管癌细胞等）中血管生长因子如血管生成素如angi1、angi2、angi3及VEGF等或其受体的表达，以及抑制肿瘤细胞中如癌基因bcl2、RAS、Tp53等突变基因及其蛋白的表达而不影响非突变基因的表达，可达到很好的抗肿瘤生长及抗肿瘤转移的目的。

抗器官移植排斥反应 —— 细胞间粘附分子-1（ICAM-1）是重要的介导细胞粘附和T细胞激活的分子，应用与ICAM-1基因序列特异的siRNA阻断 ICAM-1 mRNA和蛋白的表达，可以明显降低大鼠同种移植心的移植物血管病的发生的程度和缺血再灌注损伤。

抗病毒策略： 最早用于HIV研究，被Science评为2002年年度突破。 斯坦福医学院的研究群，把dsRNA放进小老鼠的肝细胞，dsRNA被小老鼠体內的核酸酶分解成许多siRNA。研究发现siRNA具有高度专一性，会与小老鼠体內的丙型肝炎病毒的mRNA相结合，使mRNA分解并失去转译蛋白质的功能。斯坦福医学院运用此技术来治疗丙型肝炎的研究，已从体外试管实验阶段推进至体內的动物实验。且在小老鼠身上，看到丙型肝炎病毒被阻断的明显效果。

2004年，美国FDA批准经过修饰的第一个RNAi药物Bevasiranib 进行临床新药试验，用于治疗与年龄相关的黄斑退行性改变。 功能基因组学

利用siRNA治疗疾病需要解决几个问题： （2）和给药方式，因为RNA容易被降解，如何提高siRNA在体内的稳定性； （3）高选择性。如何靶向特定细胞而不影响其他细胞。

RNAi方法在哺乳动物细胞中的应用 得益于RNAi机制的研究，小分子干扰RNA（short interfering RNA，siRNA) 概念的引入 。

哺乳动物细胞中的 RNAi 现象 长链dsRNA 干扰素 PKR, RNase L 活性化 所有基因表达下降 X RNAi 现象

RNAi过程的功能单元：siRNA 19 nt duplex 2 nt 3’ overhangs

RNAi方法的核心步骤——siRNA的设计： 1、从转录本（mRNA）的AUG起始密码下游75bp开始，寻找“AA”二连序列，并记下其后面的19个碱基序列，作为潜在的siRNA靶位点。有研究结果显示GC含量在30%—60%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更为有效。 靶点的选择往往是试验性的。

2、将候选的靶点序列和相应的基因组数据库等进行BLAST比较。 3、选出合适的目标序列进行合成。通常一个基因需要设计多个靶序列的siRNA，以找到最有效的siRNA序列。

提供RNAi 在线技术支持的公司（网站）

siRNA制备常用的五种方法： 1、化学合成 ； 2、体外转录 ； 3、长片断dsRNAs经RNase III 类降解 (e.g. Dicer, E. coli, RNase III)； 4、siRNA表达载体在细胞中表达形成shRNAs ； 5、PCR制备的siRNA表达框在细胞中表达 。

一、化学合成： 1、高质量，高纯度。 2、高成本 适用于已经验证过抑制效率的靶点序列 不适于筛选靶点序列

二、体外转录： 1、成本适中 2、省时 适用于筛选靶点序列 不适用于长期的研究或者针对某个特定靶点序列的大量研究 应用T7 RNA polymerase 体外转录方法常需要RNA的起始两个核苷酸是 GG or GA ，这样合成效率才有保障。 (Milligan 1987）

三、长片断dsRNA酶解法： 200-1000nt的dsRNA体外被RnaseⅢ家族成员切割成siRNA 不需要验证筛选多个靶点序列 适用于LOF表型分析 不适用于长期研究或者特定siRNA序列的研究

RNA polymerase III (pol III) : human U6 promoters mouse U6 promoters 四、siRNA表达质粒或者病毒载体在细胞中表达siRNAs RNA polymerase III (pol III) : human U6 promoters mouse U6 promoters the human H1 promoter

商品化载体的siRNA策略示意图

载体介导的细胞内表达siRNA 方法的特点 1、操作简便，稳定性好; 2、siRNA表达载体一旦构建成功，可以无限制的应用于研究; 3、可能建立可以调节表达的系统; 4、受转染等因素的影响比较大。 适用于长期的对于某个基因的研究，尤其是带有筛选标记的载体，能够用于构建特定基因缺陷（knockdown）的细胞株

五、siRNA Expression Cassettes (SECs)方法 快速、不需要克隆测序等步骤 适用于筛选多个候选靶点序列的抑制效率

RNAi实例： Target gene：c-myc 查找靶基因mRNA 利用网络在线支持，寻找siRNA序列 根据目的选择实现RNAi的策略：推荐载体法。 根据查找的siRNA序列，合成长链oligo 构建载体 转染 检测效应（包括干扰效应和生物学效应）

1、检索文献获取有实验证明有效的靶点序列（核对） 目的基因mRNA获取： 1、检索文献获取有实验证明有效的靶点序列（核对） 2、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ 3、http://www.google.cn or http://scholar.google.com

寻找siRNA序列 https://www.genscript.com/ssl-bin/app/rnai 支持accession number 或者序列直接输入 参数设计全面 输出经过筛选的candidate target （BLAST） 推荐★★★★★ http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html 最全面的RNA实验相关网站 有商品化的各类载体 获得siRNA target 需要手工BLAST 输出直接可递交公司合成的长链oligo 推荐 ★★★★

利用生物学软件组配长链 oligo，（合成单链DNA（直接带有4个bp的酶切位点粘性末端)； 载体构建： dsDNA形成：annealing 载体的酶切和回收 连接 转化 鉴定 转染：瓶颈之一 含有真核细胞筛选标志 含有荧光标志 效应检测：mRNA水平和蛋白水平兼顾

Down but not out! 由RNAi结果总结的结论应该客观。 目的蛋白的生物学功能特点 组成型？ 诱导型？ 高表达？ 低表达？ 转录调节为主？转录后调节？

谢 谢！