题型 一、名词解释（每题2分,共10分） 二、 判断正误，正确者划（）；错者划（）， 并改正。（每题2分,共20分） 二、 判断正误，正确者划（）；错者划（）， 并改正。（每题2分,共20分） 三、填空（每空1分,共25分） 四、选择填空题（每空1分,共10）单选 五、计算（20分） 六、简答题（15分）

第一章 绪论 第一节 生物工业下游技术的工作领域 第二节 生物工业下游技术的一般工艺过程 第三节 生物工业下游技术的发展动态 第一章 绪论 第一节 生物工业下游技术的工作领域 第二节 生物工业下游技术的一般工艺过程 第三节 生物工业下游技术的发展动态 第四节 生物产物常用的提取方法和原理 *第五节 常用的几种精制方法简介 *第六节 选择生物分离的方法和原则 *第七节 生物产物酸碱性及极性大小的测定 *第八节 提炼工作中应注意的几个问题

第一章 绪论 第一节 生物工业下游技术的工作领域 一、下游工程 第一章 绪论 第一节 生物工业下游技术的工作领域 一、下游工程 对于由生物界自然产生的或由微生物菌体发酵的、动植物细胞组织培养的、酶反应等各种生物工业生产过程获得的生物原料，经提取分离、加工并精制目的成分，最终使其成为产品的技术，通常称为下游技术（Downstream Processing），也称为下游工程或下游加工过程。

第一代(传统)生物工业主要指19世纪60年代到20世纪40年代青霉素等抗生素出现之前的生物技术产业。 二、技术范畴 物质分离★ 产品加工 三、生物工业下游技术的发展历程 1.古代酿造业 2. 第一代生物技术 第一代(传统)生物工业主要指19世纪60年代到20世纪40年代青霉素等抗生素出现之前的生物技术产业。 这一时期，发现了发酵的本质是微生物的作用，掌握了纯种培养技术。

3.第二代生物技术 第二代生物技术以20世纪40年代出现的青霉素产品为代表。 4.第三代生物技术 第三代生物技术一般认为以20世纪70年代末崛起的DNA重组技术及细胞融合技术为代表。

到了20世纪80年代以来，生物工业下游技术进步很快，出现了许多新概念、新技术、新产品和新装备。大致可将它们分为以下几大类： （1）固液分离技术 （2）细胞破碎技术 （3）初步分离纯化技术 （4）高度分离纯化技术 （5）其他新型分离技术

第二节 生物工业下游技术的一般工艺过程 一、原料及产品特性 二、下游技术的一般工艺过程 某一具体产品的分离提取工艺还与下列情况有关： （1）是胞内产物还是胞外产物； （2）原料中产物和主要杂质浓度； （3）产物和主要杂质的物理化学特性及差异； （4）产品用途和质量标准； （5）产品的市场价格； （6）废液的处理方法等。

如按生产过程划分，生物工业下游技术大致可分为4个阶段，即预处理、提取（初步分离）、精制（高度纯化）、成品制作，如书中P8图1-1所示。

第三节 生物工业下游技术的发展动态 一、传统分离技术的提高和完善 二、新技术的研究和开发 1.新型分离介质的研究开发 2.子代分离技术 3.其他新兴下游技术

三、清洁生产（Cleaner Production） 清洁生产是指将综合预防的环境保护策略持续应用于生产过程和产品中，以期减少对人类和环境的风险。它包括三方面内容，即清洁生产工艺（技术）、清洁产品、清洁能源。 清洁生产工艺是生产全过程控制工艺，包括节约原材料和能源，淘汰有毒害的原材料，并在全部排放物和废物离开生产过程以前，尽最大可能减少它们的排放量和毒性，对必须排放的污染物实行综合利用，使废物资源化。

第四节 生物产物常用的提取方法和原理 一、沉淀法 沉淀法是分离生物产物的最简单而经济的方法，浓缩倍数高，因而也是很有效的方法，其原理在于：某些生物产物能和一些无机、有机离子或整个分子形成复合物而沉淀，另外也可利用本身的等电点沉淀析出。然后将沉淀物在适宜的条件下再进行分解精制，从而得到提纯的目的。 优点：工艺简单，成本低。 缺点：适用于高单位，水不溶性物质发酵 液的提取，选择性差。

二、溶媒萃取法（液-液萃取法） 溶媒萃取法的原理在于当生物产物以不同的化学状态存在（游离酸或游离碱状态）于水及与水不溶性的溶媒中，因为有不同的溶解度，利用分配系数不同而达到浓缩和提纯目的。所谓分配系数，就是当溶质在二相充分混合达到平衡后，溶质溶于上相溶剂的浓度与溶于下相溶剂的浓度成为一定比例，即 K0=C1/C2， K0就是分配系数。

提取方式有下列几种： 单级萃取 多级错流 多级逆流萃取 优点：选择性高，收率高，生产周期短。 缺点：需要大量溶媒，对劳动保护、厂房结构、电器设备等有一定要求，需用离心机。

三、液固萃取法（或称菌丝直接萃取法） 一般生物产物（如抗生素）经代谢后分泌在菌丝体外即可采用液-液萃取法，但有一些生物产物发酵完后存在菌丝体内，不溶于水，因此这类物质的提取都是先收集菌丝，经过处理后再进行溶媒萃取。另外，一些存在于植物细胞、动物细胞以及一些植物组织、动物组织、固体中的生物物质，一般也是采取液固萃取的方法。

四、离子交换法 离子交换法系利用离子交换树脂和生物产物之间的化学亲和力，有选择性地将生物产物吸附上去，然后用较少量的洗脱剂将它洗下来，从而达到浓缩和提纯的目的。利用此法时，生物产物必须是极性化合物，即在溶液中能形成离子化合物。 优点：工艺简单、成本低，可连续化操作，有一定选择性，收率高。 缺点：周期长，不适应于不稳定生物产物的提取。

五、吸附法 系利用吸附剂与生物产物之间的分子吸附力（即范德华力）而将生物产物吸附在吸附剂上，然后再在一定的条件下，用一定的洗脱剂将其洗脱下来，从而达到浓缩和纯化的目的。 优点：简单，适用于新生物产物的提取。 缺点：劳动强度大，卫生差，选择性不高，可逆性差。

第五节 常用的几种精制方法简介 生物产物的精制过程，往往包括浓缩、精制和干燥。常用的浓缩方法有真空单效蒸发浓缩和真空薄膜蒸发浓缩，尤以薄膜浓缩用得较多，形式也多种多样。精制方法更是五花八门，但归纳起来有下列几种：

（a）脱色精制除去色素及热原； （b）结晶及重结晶，其中包括共沸结晶及盐析结晶； （c）中间体转化法； （d） 柱层析法及分子筛法； （e）其他。

一、分子筛去盐 利用分子量大小，可将无机盐杂质从目标产物溶液中除去，从而降低灰分，提高纯度。通常采用高交联度的强酸性阳离子H型树脂处理，当溶液通过它时，其中无机阳离子被吸附，释放出来的氢离子，再通过阴离子树脂，中和氢离子，这样经过两种树脂串联处理，可以达到去盐目的。

色谱分离法是一总称，它从分离的原理上可以分为： 1.吸附色层分离法:靠吸附力不同而分离。 二、色谱分离法 色谱分离法是一总称，它从分离的原理上可以分为： 1.吸附色层分离法:靠吸附力不同而分离。 2.分配色层分离法（纸层析）：靠各物质在两液相间分配系数不同而分离。 3.离子交换色层分离法：靠离子亲和力不同而分离。 4.凝胶层离法：靠物质的分子大小或形状不同而分离。 5.电泳法（电层离法）：靠电泳速度不同而分离。

但从固定相的形状不同，色层分离法可以分为柱层、纸层和薄（层）等。它的机理是多种多样的，但不管怎样，必须包括两个相: 一相是固定的，叫固定相，通常为表面积很大或多孔性固体； 另一相是流动的，是液体或气体，当流动相流过固定相时，由于物质在两相间的分配情况不同，经过多次差别分配而达到分离。

这里着重介绍具有工业生产价值的几种方法： （一）吸附色层分离法 是靠溶质与吸附剂之间的分子吸附力的差异而达到了分离精制目的。 常用的吸附剂：Al2O3、硅胶、活性炭（颗粒状），其他还有CaCO3、淀粉、纤维素等。 下面重点介绍三种吸附剂：

碱性（适应于对碱性稳定的生物产物的吸附）； 中性； Al2O3有： 碱性（适应于对碱性稳定的生物产物的吸附）； 中性； 酸性（适应对酸性稳定的生物产物的提取）之分。 Al2O3可以重复使用，洗涤后200-400度加热6小时进行活化，其活性与含水量关系很大，活性可分6级。可根据不同水分，不同温度，不同烘烤时间，可得不同活性。 表1-1 水份含量与活性的关系

硅胶 也应用很广泛，其结构式如下： 它具有多孔性的硅氧烷交链结构。 活性炭 是憎水性吸附剂，适宜于从水溶液中吸附非极性物质。 一般说来，它对极性小的化合物吸附能力大于极性大的化合物，对芳香族的吸附能力大于脂肪族的化合物，对分子量大的化合物吸附能力大于分子量小的化合物。

（二）凝胶过滤法 球型交链右旋糖酐凝胶，又名葡聚糖凝胶（简称凝胶），是一种分子筛，它由右旋糖酐和交联剂相互交联，形成具有二围空间的网状结构。按网孔的疏密将凝胶分为： G-15 G-25 G-50 G-75 G-100 网孔： 密 —————→ 疏 优点： 操作方便，不会使物质变性，可反复使用。

原理：凝胶过滤法是把含有不同大小分子的混合物溶液倒在凝胶面上，如下图，让它在凝胶柱中流滤，由于凝胶具有网络结构，当混和物通过网络结构凝胶柱子缝隙中，溶液中的溶质凡是比网络小的的分子都能自由进入胶粒内，惟有大分子由于不能进入网络，被阻于胶粒粒外，沿胶粒间的空隙往下移，从而很快流出柱外，这样就把大小分子筛离开了。

图1-2 凝胶过滤示意图

当加入洗脱液后，溶液继续往下移动，大小分子继续向相反方向扩散、渗入下移，这样先流出的洗脱液中，含有大分子物质，后流出的洗脱液中含有小分子物质，从而达到精制的目的。如图1-2。 图1-3 凝胶流出液示意图

原理：利用某种溶剂或洗涤剂对杂质的溶解度较大，通过洗涤可提高其纯度。 三、洗涤工艺 原理：利用某种溶剂或洗涤剂对杂质的溶解度较大，通过洗涤可提高其纯度。 第六节 选择生物分离的方法和原则 选择确定生物分离方法，首先必须掌握以下几个基本因素。 一、生物产物的化学结构与分类 以抗生素为例。据抗生素化学结构，抗生素大体上可以分成八大类：

β内酰胺类、氨基酸多肽类、大环内酯类、多烯类、四环类、氨基糖苷类、蒽环类、甾体类等。 各类抗生素从目前工业化生产角度来归纳，大体上每一类抗生素采用相似的方法。例大环内酯类一般采用溶媒萃取法，氨基糖苷类大都采用离子交换法，多烯类采用收集菌体，再用溶媒法萃取等等。因此，当某一新抗生素确定其化学结构后，按其分类大致上按已知抗生素提取方法来提取，是有可能的。

二、生物产物的极性及其大小 要掌握生物产物是极性化合物，还是非极极性化合物，还是两性化合物。如果是极性化合物，要考虑其极性大小，酸性还是碱性，是强酸（碱），还是弱酸（碱），进一步按其PK值，通过PK值可掌握生物产物的酸碱强度。

三、溶解度 应掌握生物产物在各种溶剂中的溶解度，是水溶性还是酯溶性以及各种溶剂的分配系数。 四、化学稳定性 测定其在不同pH、温度、时间条件下，生物产物的稳定性，并了解对化学试剂的稳定性。

五、化学反应性 要掌握了解生物产物能和哪一些无机或有机离子形成不溶性盐类，或增加其溶解度的化合物，这样便于选择是否可作为中间体转化精制方法等。

第七节 生物产物酸碱性及极性大小的测定 如抗生素酸碱性、溶解度及极性大小测定用下列三种方法大体可以确定。 一、纸上层析法（简称纸层析） 纸层析的原理，是以滤纸作为支柱，用一定的溶剂系统展开而达到分离分析的目的。每一种生物产物在一定溶剂中，均有它自己的比移值（即为Rf值）， Rf值测量示意如下图:

根据某些生物产物在同一系统中Rf值的不同，可以判断它们是不同的生物产物。 抗生素极性和溶解度的测定，通常是利用八种溶媒系统法的纸层析数据来进行的。八种溶媒系统配方如下： （一）用水饱和的正丁醇； （二）用水饱和的正丁醇，内含2%的对甲基苯磺酸； （三）正丁醇：醋酸：水＝2：1：1； （四）用水饱和的正丁醇，内含2%的六氢吡啶；

（五）0.5MPH7.0的磷酸缓冲液，用正丁醇饱和； （六）用正丁醇饱和的水，内含2%的对甲基苯磺酸； （七）苯：甲醇＝4：1，滤纸用0.5MPH7.0的磷酸缓冲液处理； （八）75%甲醇，25%水（内含NaCl 3%），滤纸用5%硫酸钠处理。

层析结果的判断： Rf值为零或很小，说明抗生素不能溶于或很少溶于所用的溶剂系统； Rf值较大，说明抗生素能够很好地溶于所用的溶剂系统。 一般极性强的抗生素易溶于极性高的溶剂中，极性弱的抗生素易溶于极性低的溶剂中。

二、pH层析色谱法 pH层析是纸层析法的一种，可用来研究某些酸类、碱类或两性生物产物在不同pH下，在有机溶剂中的溶解情况，从而可决定萃取的最适pH。pH层析的方法如下： 用九条层析纸条，分别用pH2，3，4，5，6，7，8，9，10的各种缓冲液处理，点上样品后，选用适当的水饱和的有机溶剂展开，层析完毕后用生物显影，即得到pH层离谱。几种抗生素的“pH-层析”图谱如图1-5。

（一）酸性生物产物：在“pH-层析”的图谱中的Rf值呈S形逆方向，其最大值在酸性区域，随pH增加其Rf值降低。 从图中可以看出： （一）酸性生物产物：在“pH-层析”的图谱中的Rf值呈S形逆方向，其最大值在酸性区域，随pH增加其Rf值降低。 (金霉素) 两性抗生素 （氢霉素）中性抗生素 图1-5 抗生素的层析图谱

（二）碱性生物产物：在 “pH-层析”的图谱中的Rf值呈S形曲线，曲线的最大值在碱性区域，而其最小值在酸性区域。 （三）两性生物产物：在 “pH-层析”的图谱中的Rf 值从较低的值区域中逐渐增加，到达某一最高值时开始下降，这一类化合物的Rf值从最低点到最高点表现为碱性，从最高点到pH10则表现为酸性。 （四）中性生物产物：在 “pH-层析”图谱中，在整个pH范围内， Rf值接近相同，实际上呈直线形。

2.确定用溶媒萃取法提取生物产物的最适pH值。 1.可判知生物产物的性质; 2.确定用溶媒萃取法提取生物产物的最适pH值。 具体地说，用溶剂抽提时的最适pH值， 即为“pH层析”谱中Rf值最大的pH值；相反，在“pH层析”谱中Rf值最小的pH值即为反萃取的最适pH值。

三、纸电泳法 经过系统纸层析法判断为水溶性的生物产物，可用纸电泳法进一步判断其电离性质。 原理为：不同的生物产物由于带电性质，电荷数量以及分子量的大小不同，因此在一定时间内在电场作用下，移动的方向和距离是不同的。对于带有正电荷的抗生素电泳时移向负极，称为碱性抗生素；

带有负电荷的抗生素电泳时移向正极， 称为酸性抗生素；不具有极性基团的抗 生素电泳时不移动，称为中性抗生素； 两性抗生素在电场作用下移动的方向与 溶液的pH值密切相关。 由此，利用纸电泳法可判断生物产物是：强酸性、弱酸性、强碱性、弱减性或两性、中性的，以及有可能采用何种离子交换树脂来提取。

具体做法是：试样在电压、电流相同的情况下，分别用酸性和碱性缓冲液进行电泳。两次电泳结果及判断见表1-2。

表1-2电泳结果与样品性质的判断

根据纸层析和纸电泳的结果，就可以大致决定采用何种方法提取。 第八节 提炼工作中应注意的几个问题 一、遵循四条原则。 （一）操作时间尽量缩短，在设备平衡上，争取当班能处理一批发酵液，特别是发酵液过滤。 （二）提炼温度一般要低，避免破坏，避免异构体转化，避免长菌。

（四）设备管道要勤清洗消毒，特别是过滤岗位，避免染菌污染。 二、注意发酵液质量对提炼的影响。 三、加强质量意识，正确处理产质量关系。 （三）要选择对生物产物稳定的pH值。 （四）设备管道要勤清洗消毒，特别是过滤岗位，避免染菌污染。 二、注意发酵液质量对提炼的影响。 三、加强质量意识，正确处理产质量关系。 四、应重视设备选型，提高生产效益。 五、三废治理及综合利用

思考题 1.生物产物提炼过程中一般应遵循哪些原则? 2.影响生物产物稳定性的主要因素有哪些? 3.测定生物产物酸碱性或极性大小可采用哪几种方法? 4.生物工业下游技术的发展历程。

第二章 下游技术的理论基础 第一节 下游技术中的物理学过程 一、基础物性 二、分类 以物理学过程为基础的分离操作，大致可分为以下三类。 1.平衡分离过程 这种操作是建立在相平衡关系上的。是利用相的组成差别进行混合物体系的分离的。表2-1为平衡分离代表性单元操作。大部分平衡分离操作都包含在内。

2.拟平衡(速度差)分离操作 在混合物体系本身所占有的空间之外加一个能引起物质分离的势能场，在它的作用下，形成分离场。其结果为，欲分离的物质在分离场的端面浓缩，或者在分离场内形成一个稳定的浓度分布。如表2-2所示。

3.非平衡分离操作 平衡和拟平衡分离操作以外的操作，有代表性的是利用物质移动速度差和广义的、基于“隐蔽效应”的分离操作。如表2-3所示。

三、平衡论 分离操作中，属于“平衡分离”的操作，其最大分离度由平衡关系决定。因此，弄清平衡关系是很重要的。 1.相平衡基础 多组分混合物体系达到气液、液液、固液、气固两相平衡的条件是各相温度、压力相等，各相中各成分的逸度相等。当系统整体的温度和压力均相同，多相系统达到相平衡时，可用吉布斯相律描述：

F＝C－P＋2 （2-1） 式中 F—自由度 C—组分数 P—相数 2.气液平衡 气液平衡关系是蒸馏、气体吸收和超临界流体萃取等分离操作的理论基础。对于非理想溶液，组分i在平衡气相中的分压pi和其液相组成xi关系如下：

αi—组分i的活度，而 γi —组分i的活度系数，可由有关公式求得 当γi ＝1时，即为理想溶液，则： pi ＝ pi*αi ＝ pi*γi xi （2-2） 式中 pi*—纯组分i的饱和蒸气压 αi—组分i的活度，而 αi ＝γi xi γi —组分i的活度系数，可由有关公式求得 当γi ＝1时，即为理想溶液，则： pi ＝pi*xi (即拉乌尔定律) （2-3）

而挥发度： υi＝ pi/xi （2-4） 相对挥发度： αij ＝ υi/ υj （2-5） 式中υj——组分j的挥发度 高压领域中，除气液平衡，还存在液-液平衡、气-液-液三相平衡或气-气平衡，相平衡图较为复杂。 3．溶解度 (1)气体在液相中的溶解度 亨利定律是气体吸收的理论基础。 亨利定律 pi＝yip＝H xi （2-6） 式中 pi —组分i的气相分压

H—亨利常数 xi，yi—分别为组分i的液相和气相摩 尔分数 （2）固体在液相中的溶解度 4．高压气体中的溶解度 p —总压 H—亨利常数 xi，yi—分别为组分i的液相和气相摩 尔分数 （2）固体在液相中的溶解度 4．高压气体中的溶解度 超过临界温度和临界压力的气体称为超临界气体，其特征是各种物质在超临界气体中的溶解度较大，而且在临界点附近溶解度变化很大，利用这个性质的萃取技术称为超临界萃取技术。

5．液-液平衡 6. 吸附平衡 7. 固体吸收平衡 四、传递现象 1.传递通量 2.固相内的分子扩散 3.多孔体内的扩散运动 (1)微孔内扩散 (2) 表面扩散 4.粒子充填床层中的物质扩散 5.膜内物质的质量传递

第二节 下游技术中的化学过程 一、化学性分子识别 1.分子间相互作用 2.分子识别 二、下游技术中的化学反应

第三节 下游技术中的生物学过程 一、特异性相互作用（锁钥关系） 生物学分离过程的主要特征是生物高分子的特异性相互作用。有时也被称作生物亲和力。 这种作用，除共价结合外，还有其他一些作用。 1.离子间的相互作用 2.氢键结合 3.疏水性相互作用 4.对金属原子配位 5.弱共价键结合

影响上述作用的因素： （1）热 （2）温度 （3）PH值 （4）静电性的环境变化 （5）试剂 二、亲和色谱 亲和色谱是利用了生物物质间的特异性相互作用，或者说是利用了某些生物物质之间特异的亲和力进行选择性分离的一种色谱分离技术。

选择用于亲和色谱的载体时，应满足下面的条件： （1）具有亲水性。 （2）具有载体固定化时能利用的适当的官能团。 （3）目标物质以外的非特异性吸附很少。 （4）有一定机械强度。

思考题 1.化学性分子识别和生物学的特异性相互作用二者的相似和区别是什么? 2.如何利用化学性分子识别和生物学的特异性相互作用这些性质来研究和发展下游技术?请了解近年来这方面的发展实例。