6.7 维生素类药物的分析

概 述 一、定义 维生素是维持人体正常代谢功能所必需的微量生物活性物质，主要用于机体的能量转移和代谢调节，体内不能自行合成，必须从食物中摄取。

二、分类 脂溶性 VitA、D2、D3、 E、K1 等 水溶性 VitB族 (B1、B2、B6、B12) VitC、叶酸、烟酸、烟酰胺 VitM VitPP

维生素A的功能及来源 VitA 以不同方式几乎影响机体的一切组织细胞。 维持正常的视觉反应， 维持上皮组织的正常形态与功能。

三、分析方法 本类药物的分析方法很多，有生物法、微生物法、化学法和物理化学法，多依据其生物特性及理化性质进行，但目前常用的分析方法是化学法或物理化学法。

第一节 维生素A（Vitamin A） 维生素A包括有维生素A1（视黄醇）、去氢维生素A（维生素A2 ）和去水维生素A（维生素A3）等，其中维生素A1活性最高，维生素A2的生物活性是维生素A1的30-40%，维生素A3的生物活性是维生素A1的0.4%，故通常所说的维生素A系指维生素A1。

一、结构和性质 -H 维生素A醇 -COCH3 维生素A醋酸酯 -COC15H31 维生素A棕榈酸酯 R :

1、为一个具有共轭多烯侧链的环己烯 （1）具有UV吸收 （2）存在多种立体异构化合物 （3）易发生脱氢、脱水、聚合反应

2、不稳定性 △或有金属离子存在时更易氧化

3、与三氯化锑发生呈色反应 CHCl3 4、溶解性 不溶于水 易溶于有机溶剂和植物油等

维生素A在饱和无水三氯化锑的无醇氯仿溶液中呈现不稳定的蓝色，再变为紫红色。 二、鉴别试验 1、三氯化锑反应 维生素A在饱和无水三氯化锑的无醇氯仿溶液中呈现不稳定的蓝色，再变为紫红色。 CHCl3

反应条件： ① 要求无水，如存在水可能产生氯化氧锑（ SbOCl ）。 ② 配制所用的氯仿不能含醇（应用无醇氯仿）和光气（COCl2）。 ③ 三氯化锑有腐蚀性。

2、紫外吸收光谱 维生素A分子中含有5个共轭双键，其无水乙醇液在326nm波长处有最大吸收。当在盐酸催化下加热，即发生脱水反应生成去水维生素A（A3）。去水维生素A比维生素A多一个共轭双键，其最大吸收波长向红移，在340～390nm波长间出现3个最大吸收峰。 3、薄层色谱

三、含量测定 1、紫外分光光度法 利用维生素A醇和其醋酸酯分子中具多烯共轭体系结构，在325～328nm处有选择性吸收峰，故可进行含量测定。

立体异构体 氧化产物及光照产物 合成中间体 去氢维生素A（ VitA2） 去水维生素A（ VitA3） 均对测定有干扰，故采用三点校正法

三点校正法 （1）条件： ① 杂质的吸收在310~340nm波长范围内呈一条直线，且随波长的增大吸收度减小； ② 物质对光的吸收具有加和性。

（2）波长的选择： ① 1 VitA的max（328nm） ② 2 3 分别在1的两侧各选一点

（3）测定方法： ① 第一法（直接测定法） 测定对象 VitA醋酸酯

② 第二法（皂化法）：用醇制氢氧化钾加热皂化（水解），用乙醚提取，挥干溶剂，残渣用异丙醇溶解，测定含量。 测定对象 VitA醇

第一法与第二法的区别 第一法 第二法 测定对象 维生素A醋酸酯 维生素A醇 方法 直接取样，测定 皂化提取，测定 溶剂 环己烷 异丙醇 第一法 第二法 测定对象 维生素A醋酸酯 维生素A醇 方法 直接取样，测定 皂化提取，测定 溶剂 环己烷 异丙醇 max 328 nm 325 nm 测定波长 5个 4个 换算因数 1900 1830

（二）三氯化锑比色法 维生素A可与三氯化锑的氯仿溶液作用，产生蓝色，在618～620nm波长处有最大吸收。可用于维生素A的比色测定。要求在5～10秒内测定。本法缺点多，已被UV法取代。 （三）高效液相色谱法

第二节 维生素B1的分析 维生素B1（盐酸硫胺） HCl Cl- 氨基嘧啶环－CH2－噻唑环(季铵碱)

（一）结构与性质 （1）溶解性 ①易溶于水 ②水溶液呈酸性 （2）UV共轭双键 λmax = 246nm

（3） 硫色素反应 （4） 碱性 嘧啶环 —— 伯氨 噻唑环 —— 季铵 1、可与酸成盐 2、与生物碱↓→↓ 3、含量测定 —— 非水碱量法

（二）鉴别试验 1、硫色素反应（VitB1的专属反应）

2、沉淀反应 H+ H+ VitB1 H+ H+

（三）含量测定 1、非水溶液滴定法（药典用于测定原料药） 原理：利用噻唑环上季铵和嘧啶环上氨基的弱碱性，在非水溶液中用高氯酸液滴定。

2、UV分光光度法（药典用于测定片剂、注射剂） （1）原理：维生素B1分子中具有共轭双键结构，具有紫外吸收特征，可在其最大吸收波长下测定吸收度，根据取样量计算含量。 （2）方法

（三）硫色素荧光法 原理 （1） NaOH 激发波长365nm 发射波长435nm （2）方法与计算

S + NaOH + 铁氰化钾 + 异丁醇 + NaOH + 异丁醇 对照液 d + NaOH + 铁氰化钾 + 异丁醇 + NaOH + 异丁醇 A 供试液 b

（3）特点 ①灵敏度高，线性范围宽 ②代谢产物不干扰，适用于体液分析

第三节 维生素C的分析 L－抗坏血酸

(一）结构与性质 1、溶解性 ① 易溶于水 ② 水溶液呈酸性

2、酸性 一元酸 C3－OH的 pKa = 4.17 C2－OH的 pKa = 11.57

3、强还原性 二烯醇结构 二烯醇结构 二酮基结构

4、光学活性 手性C（C4、C5） * L(+)－抗坏血酸 活性最强

5、具糖的性质 结构与糖类相似 糖类的显色反应 △ 50℃

6、UV特征

（二）鉴别试验

1、与AgNO3反应 (ChP2000) 2、与2，6 - 二氯靛酚反应 (ChP2000) 还原型 氧化型 蓝色 OHˉ 玫瑰红色

3、与碱性酒石酸铜反应 USP 4、与KMnO4反应 5、糖类的反应 6、紫外分光光度法

（三）杂质检查（略） 1、溶液的澄清度与颜色检查 2、铁、铜离子的检查：原子吸收分光光度

（四）含量测定 1、碘量法 原理 （1） 指示剂 淀粉指示液

（2）方法 取本品约0.2g，精密称定，加新沸过的冷水100ml与稀醋酸10ml使溶解，加淀粉指示液1ml，立即用碘滴定液（0.1mol/L）滴定，至溶液显蓝色，在30秒内不褪。每1ml碘滴定液(0.1mol/L)相当于8.806mg的C6H8O6

（3）讨论 ① 酸性环境 d . HCl 减慢VitC被O2氧化速度 ② 新沸冷H2O 减免水中O2的干扰 ③ 立即滴定 减少O2的干扰

（二）2，6 - 二氯靛酚钠滴定法 USP JP 原理 （1）

（2）方法 自身指示终点法

（3）讨论 ①酸性环境 HPO3-HAc 稳定VitC ②快速滴定 2min内 防止其他还原性物质干扰 ③剩余比色测定 （定量过量） （测剩余染料）

（4）缺点 不稳定 需经常标定 贮存≤一周 干扰多 氧化力较强 （三）高效液相色谱法

第四节 维生素D的分析 维生素D是一类抗佝偻病维生素的总称。目前已知的维生素D类物质至少有十种之多，它们都是甾醇的衍生物。中国药典主要收载有维生素D2、D3原料药；维生素D2胶丸和注射剂；维生素D，注射剂。USP(24)收载有片剂、胶囊、口服液等剂型。BP(2000)收载的剂型有片剂、口服液、注射液以及钙与维生素D2、D3制成的复方片剂。

一、结构与性质 (一)结构 维生素D3为9，10-开环胆甾-5，7，10(19)三烯-3β-醇，又名胆骨化醇。 两者的化学结构十分相似，其差别仅是维生素D2比维生素D3在侧链上多一个双键，C24上多一个甲基。

VD2 VD3

(二)性质 1、性状 维生素D2、D3均为无色针状结晶或白色结晶性粉末；无臭，无味；遇光或空气均易变质。

5、显色反应 本品的氯仿溶液，加醋酐与硫酸，初显黄色，渐变红色，迅即变为紫色，最后变为绿色。本反应为甾类化合物的共有反应。 6．紫外吸收特性 取本品，加无水乙醇溶解并定量稀释制成每10ml中约含10ug的溶液。照分光光度法，在265nm的波长处测定吸收度，维生素D2的吸收系数为460-490；维生素D3的吸收系数为465-495。

二、鉴别试验 (一)显色反应 1、与醋酐－浓硫酸反应 取维生素D2或D3约0.5mg，加氯仿5m1溶解后，加醋酐0.3ml与硫酸0.1ml，振摇，维生素D2初显黄色，渐变红色，迅即变为紫色，最后成绿色。维生素D3初显黄色，渐变红色，迅即变为紫色、蓝绿色，最后变为绿色。 2、与三氯化锑反应 取本品适量(约1000单位)，加1，2-二氯乙烷1m1溶解，加三氯化锑试液4ml，溶液即显橙红色，逐渐变为粉红色。 3、其它显色反应 维生素D与三氯化铁反应呈橙黄色，与二氯丙醇和乙酰氯试剂反应显绿色，均可用于鉴别，但专属性不强。

(二)比旋度鉴别 取维生素D2，精密称定，加无水乙醇溶解并定量稀释制成每1m1中含40mg的溶液，依法测定，比旋度为+102.5。至+107.5。；维生素D3加无水乙醇溶解并定量稀释制成每1ml中含5mg的溶液，依法测定，比旋度为十105。至+112。(二者均应于容器开启后30min内取样，并在溶液配制后30min内测定)。 (三)其他鉴别方法 维生素D2、D3可用薄层色谱法、HPLC法和制备衍生物测熔点进行鉴别。此外，亦可通过其紫外、红外吸收光谱的特征加以鉴别。

(四)维生素D2、D3的区别反应 取维生素D10mg，溶于96％乙醇10ml中。取此液0.1m1，加乙醇1ml和85％硫酸5ml。维生素D2显红色，在570nm波长处有最大吸收；维生素D3显黄色，在495nm波长处有最大吸收。 此反应也用于D2和D3的含量测定。

三、杂质检查（略） (一)麦角甾醇的检查 (二)前维生素D的光照产物

四、含量测定（略） (一)维生素D测定法 （二）讨论 维生素D的含量测定方法各国药典各异。USP(24)关于维生素D的测定方法有化学法、色谱法和微生物法；BP(2000)有化学法、光谱法和色谱法；而中国药典采用正相高效液相色谱法测定。 (一)维生素D测定法 （二）讨论

第五节 维生素E的分析 维生素E（消旋-α-生育酚醋酸酯） 苯并－二氢吡喃醇

* * * 名 称 R1 R2 相对活性 α-生育酚 β-生育酚 γ -生育酚 δ -生育酚 CH3 H 1.0 0.5 0.2 0.1

生物效价 右旋体 ： 消旋体 = 1.4 ：10 （天然品） （合成品） dl－α－生育酚醋酸酯

（一）结构与性质 苯环 + 二氢吡喃环 + 饱和烃链 1、易溶于有机溶剂，不溶于水 2、UV 3、酯键 易水解 △

（二）鉴别 1、硝酸反应 75℃15′ 橙红色

2、三氯化铁－联吡啶反应 △ [O]

3、紫外光谱法 4、薄层色谱法 5、其他方法

（三）杂质检查 1、酸度 2、生育酚 （1）原理：利用游离生育酚的还原性，将硫酸铈还原成硫酸亚铈 （2）试剂 硫酸铈滴定液（0.01mol/L） 二苯胺（亮黄→灰紫）

（四）含量测定 1、GC法 （1） GC特点 选择性好 灵敏度高 速度快 分离效能好 挥发性低、不稳定、极性强→衍生化易受样品蒸气压限制

本 章 小 结 1、VitA：掌握三氯化锑鉴别反应的原理、 UV法含量测定的原理及两种测定方法的区别。 3、 VitB1：掌握硫色素反应（鉴别及含量测定）的原理。

3、 VitC：掌握其结构特征（还原性）、碘量法含量测定的原理及操作注意事项。 4、VitE：掌握硝酸反应的原理。

药品生产的主要环节 反应→分离→制剂 构成了药品生产的主要工艺环节。 原料在反应器内进行反应，通过分离等方法获得原料药，原料药经过一定的制剂工艺（如混合、造粒、干燥、压片、包衣、包装等）即成为药品。

合格的药品不是检验出来的，而是生产出来的。 生产的药品质量是否合格，与生产过程中的每一个环节均密切相关，除控制原料质量外，制药过程关键工艺的控制是影响药品质量的重要因素，对其进行监控、控制对于保证药品质量至关重要。

制药过程分析的新革命 过去，生产过程的分析和控制常常依靠操作人员的经验。 现在，制药过程控制自动化程度越来越高，原来由人工控制的操作逐渐被自动化设备所代替。 随着自动化程度的不断提高，对动态的制药过程进行化学成分的瞬时追踪，在线监测和优化控制已经成为现代制药工业的迫切要求。

制药过程分析方法分类 按照分析测试的程序不同，应用于制药的过程分析技术分为以下类型： 离线分析（off-line）即从生产现场采样后带回实验室进行处理分析。 近线分析（at-line）也叫现场分析，人工采样后在现场（接近生产线的地方）进行分析。 离线分析和近线分析的工作方式实质上跟一般的实验室分析工作没多大的区别，是制药工业传统分析方式，他们的分析结果都只能说明生产过程“过去”某一时间的状况，提供的滞后的信息。

制药过程分析方法分类 连线分析（on-line）也称侧线分析。指依靠自动采样系统，直接从生产流程抽取样品，自动输入分析仪器中进行连续或间歇分析。 在线分析（in-line）也称内线分析。样品不用取出，将监测探头插入生产流程中直接在生产线上进行实时连续的分析。 连线分析和在线分析使真正的实时分析成为可能，它所提供的分析信息直接反映了当时的生产状态。

制药过程在线分析的特点 制药过程在线分析的基本要求：快速、简便、易于重复。 制药过程质量监测与一般药物分析不同，快速是第一要求。过程监测要求在较短时间内迅速获取分析结果，用于监测药物生产工艺过程是否顺利进行以及产品的质量状况，以控制生产。 在保证快速的条件下，准确度可以在允许限度内适当降低。

在线分析仪器 在线分析仪器是指能对试样的化学成分性质及含量进行在线自动测量的一类仪器。 在线分析仪器的特点： 有自动取样和试样品预处理系统，无需人工取样和处理； 完全自动化，具有自动检错、报警和校正功能。 仪器稳定性要好，要禁受高温、高湿、腐蚀性、振动等影响，以利于长期使用。

过程分析仪器的组成 通常由五部分组成。 取样装置与预处理系统 检测器 信号处理系统 结果输出 整机自动控制系统 分析仪器必须快速 地分析测试信号进行 响应，自动地处理和 存贮数据及其结果； 尤其是在过程控制分 析中，还要求分析仪 器能快速地反馈测试 结果，为生产控制提 供依据。 通常由五部分组成。 取样装置与预处理系统 检测器 信号处理系统 结果输出 整机自动控制系统

制药过程分析仪器 制药过程分析仪器分类可依据三种情况。 按照测量的参数数目可分为单参数和多参数在线分析仪器。 按照检测原理可分为色谱式、光谱式、电化学式、热化学式等。 按照检测仪器的使用方式可分为定点式，移动式和潜入式三类。

制药过程分析技术 在线近红外光谱分析(Near Infrared，NIR) 测定原理 分子中C-H,N-H,O-H,S-H等含氢基团在近红外光（780-2526nm）作用下有特征吸收。 NIR是一种间接测定方法，需先建立标准样品近红外光谱与待测组分含量的校正模型，然后将待测样品的近红外光谱数据代入校正模型，计算出其中待测组分的含量。

在NIRS分析测试中，首先需要依据已知样品化学信息，用多元校正方法（多元线性回归法、主成分分析法、偏最小二乘法、人工神经网络法等）建立校正模型，然后测定未知样品的NIRS，用建立的校正模型处理未知样品的NIRS数据，获取其化学组成信息。

NIR分析技术的特点： 操作简便、分析快速，定量精度高。相对误差低于±0.5% 不破坏分析样品，不使用化学试剂，不污染环境。 可以进行原位测量和远距离分析，可使用光纤传输信号，适宜于在线的过程控制分析。 不需要对样品预处理，直接对颗粒状、粉末状、糊状、不透明状试样进行分析。 只能做常量分析 检测极限为0.1%

在线NIR技术的应用 对生产原料质量的评价 通过光导纤维将传感探头与NIR分析仪连接，可在原料进入生产车间时，立刻分析检测每种每批生产原料的质量。 合成反应的终点控制 应用于药物合成的在线控制中，把探头直接插入反应液中，确定反应终点。

在线NIR技术的应用 控制粉末混合均匀性 采用NIRS技术，将近红外光纤探针插入搅拌机的旋转轴，得到相应光谱，应用编辑的程序收集相关数据，反映粉末混合程度。 中药活性成分提取过程的控制 杨南林等以黄连提取物为例，采用光纤NIR透射光谱技术，建立了中药黄连大孔吸附树脂纯化过程的分析方法，测定了洗脱物中多个化学组分的浓度，实现了中药纯化过程的在线检测。 杨南林,程翼宇, 瞿海斌. 一种用于中药纯化过程的近红外光谱分析新方法[J]. 化学学报,2OO3, 61(5): 742~747.

在线NIR技术的应用 NIR技术倍受过程分析青睐

在线色谱技术 色谱技术具有适用范围广，分离效率高，流动相选择范围广，不受分析对象挥发性和热稳定性的限制，样品预处理简单，检测灵敏等特点。 HPLC、GC与质谱、核磁共振、固相微萃取等技术用，使其成为在药物研究、质量检定、药品生产和临床检测中的最主要的分离分析工具。 过程色谱通过多柱切换的方法，对生产过程实现实时在线分析。

在线色谱技术的应用 合成过程控制 将自动取样装置装在反应器中取样，样品经过预处理注入色谱柱进行分析，通过测定反应器中产物浓度，可计算出合成反应收率、从而控制药物质量。 蛋白质分离 建立了色谱过程自动监控系统，可实时监控设备运转，自动分析数据，控制分离过程。

在线色谱技术的应用 发酵过程监测 通过采用HPLC法监测抗生素发酵过程的糖消耗量，控制反应。 药物中易挥发成分分析 检测其挥发性成分的含量，利用顶空气相色谱（HSGC）法，对中药中挥发性成分进行快速鉴定，监控其质量。

流动注射分析 流动注射分析（FIA）于1975年创立。 采用把一定体积的样品注入到无气泡间隔的流动试剂中，在非平衡状态下完成样品的在线处理与测定。 P183 FIA系统过程示意图 试剂注入连续的样品溶液中，与被测物混合，当混合液经过检测器时样品量即被检测。

流动注射分析系统 载流驱动系统 蠕动泵，用于驱动载流进入管路。载流为用于载带样品的流动液体，其中可以是样品，也可以是与试样反应的试剂。 载流驱动系统 蠕动泵，用于驱动载流进入管路。载流为用于载带样品的流动液体，其中可以是样品，也可以是与试样反应的试剂。 注样系统 注样阀或注样器，用于将一定体积的样品注入载流中。 反应系统 是一段由细管道构成的盘管，样品与试剂在此发生反应。 检测系统 采用流通式检测器，用于检测从反应器出来的反应产物，常用的有光度法，色谱法，电化学法。 信号读出装置和记录仪 记录峰形信号

流动注射分析的基本过程 综上，流动注射分析的基本过程：注样阀把一定体积的样品注入连续的载流中，随载流进入反应器，在反应器中与试剂发生反应，反应产物流经检测器时被检测，记录仪读出信号，一般用峰高进行定量。

流动注射分析应用 FIA分析具有高效率、高精度、低能耗的特点，应用非常广泛。主要用于在线监测。 反应过程监测 废水废弃物的分析 如废水中磷含量的测定 生物制药过程在线分析 生物发酵过程中的葡萄糖、氨基酸、青霉素等均能用流动注射分析法监测。

其他在线分析技术 紫外-可见吸收光谱分析法 适用于监测具有紫外吸收或发生显色反应的物质，且需无其他物质的干扰吸收。 紫外-可见吸收光谱分析法 适用于监测具有紫外吸收或发生显色反应的物质，且需无其他物质的干扰吸收。 电化学分析法 电位检测器、电导检测器和自动电位滴定检测系统 拉曼光谱分析法 聚焦光束反射分析法

典型的制药过程分析 温度控制 温度是制药生产过程中重要的影响因素。从化学反应、中药提取浓缩、到最后的纯化精制、制剂等，温度的影响无处不在。 温度控制系统由主副两个调节器串联组成。主调节器调节生产工艺中的主要控制指标，如反应罐温度。副调节器主要控制由于某种特殊需要而引入的温度辅助调节。

典型的制药过程分析 压力控制 制药生产中，压力的控制始终存在，作为生产的重要保障因素，它始终受到人们的重视。 压力控制系统各采集点收集现场压力数据，输送至计算机，计算机根据反馈值进行分析计算，将计算出的控制量转换为电流信号，控制压力调节阀的开度大小，借以调节进气或排气量的大小，使压力达到要求。

典型的制药过程分析 pH控制 制药生产中，为了保证产品的质量稳定均一，自动、可靠的pH控制调节系统是必须的。 pH控制系统各采样点通过设置的pH电极采集到的pH实时数据，输送至系统主机，主机根据反馈值与设定的控制参数比较，控制加酸（碱）电磁阀的开启和延时，使控制点的pH升高（降低），从而实现系统pH的定值控制。

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