Bacillus subtilis中羟基丁酮诱导的表达系统 专业：生物化工 学号：2012207258 姓名：杨绍梅 导师：班睿

目录 1 对羟基丁酮的简要介绍 2 羟基丁酮的合成及调控机制 3 羟基丁酮的代谢及调控机制 4 结论及展望

1 对羟基丁酮的简要介绍 羟基丁酮（acetoin），又名乙偶姻、甲基乙酰甲醇，具有独特的奶油香味和羟基、羰基等官能团，是一种重要的化学合成中间体和多功能材料，广泛应用于食品、制药、化工以及烟草等领域。 目前，羟基丁酮的主要生产方法有：化学合成法、酶转化法和微生物发酵法。由于微生物发酵法具有生产成本低、对环境友好、产品纯度高、反应条件温和等优势，能解决化学合成法和酶转化法所面临的环境、资源、产品质量等问题，已成为羟基丁酮的研究热点。

2 羟基丁酮的合成及调控机制 2.1 羟基丁酮的合成 acetoin是许多微生物糖代谢的中间产物，自然界中可转化糖生产acetoin的微生物主要有Enterobacter、Bacillus等。 在B.subtilis内，acetoin的合成途径主要有2条： 2分子丙酮酸在ilvBN编码的α-乙酰乳酸合成酶（AHAS）的作用下合成一分子α-乙酰乳酸，α-乙酰乳酸在酸性条件下非酶自然氧化脱羧生成2，3-丁二酮，2，3-丁二酮在丁二酮还原酶或2，3-丁二醇脱氢酶的作用下还原生产acetoin； 另一条途径是2分子丙酮酸在alsS编码的α-乙酰乳酸合成酶（AlsS）的作用下合成1分子α-乙酰乳酸，α-乙酰乳酸经alsD编码的α-乙酰乳酸脱羧酶（AlsD）作用生成acetoin。

图1 羟基丁酮的合成代谢相关途径

alsSD操纵子的基因结构 在B.subtilis 中，alsS和alsD构成一个alsSD操纵子，其表达受alsR的调控。alsSD位于B.subtilis基因图谱的314°，和alsR形成一对反向操纵子，alsR与alsSD的转录起始位点相差64bp，两者的调控序列重合。 图2 alsSD操纵子与alsR基因的结构

alsSD的转录起始位点上游有类似于识别σA启动子的序列，-35区和-10区之间相差17bp；在-76~-58bp有19bp的高亲和性回文结构结合位点TAAT-N11-ATTA，是调控蛋白结合位点（RBS）；在-41~-27bp有15bp的低亲和性回文结构结合位点AT-N11-AT，是激活蛋白结合位点（ABS）。 AlsR与这两个位点结合诱导形成转录所需的高级复合物。alsSD中AlsR结合位点RBS序列与alsR转录起始位点重合；ABS序列与alsSD的-35区重合；alsSD的-35区和alsR的-35区有2bp重叠。

2.2羟基丁酮合成的调控机制 2.2.1 AlsR对alsSD操纵子的调控机制 alsR的表达受自调节负控，当AlsR水平较低时，RBS和ABS位点空闲，RNA聚合酶可以结合启动子，起始alsR的转录；当AlsR水平提高后，RBS和ABS位点先后被AlsR占据，阻碍了RNA聚合酶与启动子的结合，alsR的转录受到抑制。 如果与RBS和ABS位点结合的AlsR蛋白，以活性八聚体的形式存在于alsSD操纵子-10区的上游，则促进RNA聚合酶起始alsSD操纵子的转录。

A：AlsR形成二聚体或四聚体形成延迟蛋白/DNA复合体I或II，结合在alsSD操纵子的ABS或RBS位点。 B：AlsR形成二聚体或四聚体形成延迟蛋白/DNA复合体I、II或III，结合在alsSD操纵子的ABS和RBS位点。 C：AlsR的活性八聚体结合在alsSD的操纵子调控序列处。 图3 AlsR与DNA结合的形式

2.2.2 CcpA对alsSD操纵子的调控机制 CcpA蛋白是B.subtilis及其他革兰氏阳性菌内碳源代谢的调控中心，是转录调控蛋白LacI/GalR族中的一员，与目标基因启动子区域保守的cre位点结合，对葡萄糖的应答是由HPr/Crh信号通路介导的。 尽管CcpA作为阻遏蛋白阻遏关于二级碳源利用的基因的表达，但是B.subtilis在葡萄糖培养基生长时的碳源代谢途径，包括乙酸、羟基丁酮、糖原的生成途径都需要CcpA激活。 CcpA是碳利用基因的负调控蛋白，也是乙酸和羟基丁酮合成与分泌的正调控蛋白。

alsSD操纵子中无cre位点，alsR基因编码LysR族转录调控因子AlsR，是alsSD转录的激活剂。在营养生长时加入外源乙酸可增加alsSD的转录，因此认为乙酸是控制AlsR依赖性激活的效应物。这表明：CcpA对alsSD的影响是间接的，由于ackA/pta路径对CcpA具有依赖性，因此CcpA可能通过乙酸的积累介导对alsSD的调控。 图4 CcpA介导的基因表达的控制模型

3 羟基丁酮的代谢及调控机制 3.1 羟基丁酮的代谢 acetoin的意义在于抵御环境的酸化、参与NAD+/NADH 比率的调节、作为储存碳源。正常情况下acetoin在微生物体内是不会积累的， acetoin即使在微生物为了抵御不良环境而作为储存能源积累时，在葡萄糖等易同化碳源耗尽后也会被继续消耗来维持自身的生命活动，这充分表明微生物体内存在acetoin的分解代谢体系。 在B.subtilis内， acetoin的分解代谢是由羟基丁酮脱氢酶酶系( AoDH ES) 催化完成的，包括：依赖于焦磷酸硫胺素的羟基丁酮脱氢酶( AoDH E1) 、二氢硫辛酰胺乙酰( 基) 转移酶( AoDH E2) 和二氢硫辛酰胺脱氢酶( AoDH E3) ，acoABCL操纵子编码该羟基丁酮脱氢酶亚基。

acoABCL操纵子的基因结构 羟基丁酮脱氢酶酶系的结构基因acoA(编码AoDH E1的α-亚单位)、acoB (编码AoDH E1的β-亚单位)、acoC (编码AoDH E2 )和acoL基因(编码AoDH E3)在染色体上呈线性依次排列。 acoA、acoB、acoC、acoL和acoR之间的间距分别为3 bp、13 bp、28 bp和115bp。 σ54识别的启动子位于acoA上游的39bp处，四个基因的启动子识别序列是-24区的5'-TGGCAC-3'和-12区的5'-CTTGCA-3'。当σL突变时，acoA启动子无法转录；σL结构基因中间有CcpA结合位点cre-box，并通过“路障”机制调控σL的转录。 图5 aco基因簇的的结构[15] 图6 σL基因结构

3.2 羟基丁酮的调控机制 acoABCL操纵子的表达受葡萄糖的抑制，受羟基丁酮的诱导；该操纵子的启动子受σL的调控，并需要激活剂AcoR，编码AcoR的acoR基因位于acoABCL序列的下游。 在葡萄糖存在的条件下，acoR的表达受CcpA的强烈抑制，因此可能仅在无葡萄糖的条件下，acoR才表达；激活剂AcoR识别并结合acoABCL启动子上游的90bp大小的调控序列，从而在羟基丁酮存在的条件下激活操纵子的表达。

3.2.1 acoR对acoABCL操纵子的调控作用 acoR基因位于acoABCL操纵子的下游，和acoABCL是两个不同的转录单元，编码激活操纵子转录的激活蛋白AcoR。AcoR与σ54依赖型启动子的转录激活物相似，这一激活蛋白家族包含一个220-240氨基酸残基形成的中心区域，通过与RNA聚合酶或σ54相互作用，形成RNA聚合酶和（-12，-24）启动子的开放复合物。 acoABCL操纵子的四个基因在acoR缺陷株中不能转录，需要上游激活区域-123 ～ -85bp（该区域含有3个拷贝的六核苷酸序列5‘-GAGACA-3’）和位于-91bp的11个核苷酸的回文序列，这些可能与AcoR的结合有关。

图7 acoR启动子区域结构 下划线表示可能的cre-box序列，粗体字表示推测的-10与-35区，方括号表示CcpA保护区

3.2.2 CcpA对acoABCL操纵子的调控 acoR的表达不受acetoin的诱导，也不受自我调控，其转录受CcpA的负调控。acoR上游区域有CcpA的特殊结合位点，在acoL和acoR的中间区域有两个cre-box，位于acoR的起始密码子ATG上游的45-71bp处，因此CcpA是acoR转录的阻遏物。 B.subtilis中σL结构基因内部有CcpA结合位点cre-box，通过“路障”机制调控σL的转录：CcpA与σL结构基因内cre位点的结合阻碍了该位点下游mRNA的有效合成，因此被称为“路障”机制。

4 结论及展望 羟基丁酮是B.subtilis在葡萄糖或其它发酵碳源的培养基中生长时的主要溢流代谢产物，在葡萄糖等易同化碳源耗尽后又会被继续消耗来维持自身的生命活动，其中 alsSD操纵子负责羟基丁酮的生物合成； acoABCL操纵子负责羟基丁酮的分解代谢。

acoABCL操纵子的表达受葡萄糖的抑制、受羟基丁酮的诱导；其启动子受σL的调控，同时需要激活剂AcoR，AcoR识别并结合acoABCL启动子上游的90bp大小的调控序列，从而在羟基丁酮存在的条件下激活操纵子的表达；在葡萄糖存在的条件下， CcpA强烈抑制acoR的表达。 这些特性使acoABCL操纵子的启动子（acoA启动子）成为B.subtilis表达系统应用中最具优势的候选者，羟基丁酮表达系统成为在B.subtilis内表达外源基因的最具竞争力的表达系统。

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