Hybridization Based Marker- Dot Blotting Reverse Northern Blotting

DNA微阵列（Microarray） 利用DNA芯片技术，将大量探针固定于玻/硅片上，然后用荧光标记样品进行大量分子杂交，以比较不同组织或器官的基因表达水平，筛选突变基因，分析基因表达模式。 优点：密度高、制作方便，解决了传统核酸杂交技术复杂、自动化程度低、检测目的分子数量少、低通量等不足

产生信号（Signal Generated） 扫描光强度 计算机复合 灰色 偏红、偏绿

微型化 生物芯片的特征与优点 高通量—提高信息量 平行化—提高信息的可比性 微量化—降低待检样品用量 自动化—提高工作效率 低成本—可迅速普及推广

Hybridization Based Marker- VNTR Variable number of tandem repeat Main difference is RE does not cut within the probe but on flanking regions Technique relies on short sequences (10 - 100 bp) repeated within the restricted fragment Differences in the number of repeats can be detected by difference in length

Principle of VNTR Analysis

Molecular marker— PCR－based markers 7

PCR（聚合酶链式反应） 全称：Polymerphase Chain Reaction 基本原理：是在试管中模拟细胞内的DNA复制

Brief on PCR 1971年，Khorana提出：经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。 但由于测序和引物合成的困难，以及70年代基因工程技术的发明使克隆基因成为可能，所以，Khorana的设想被人们遗忘了……

Brief on PCR 1993年度诺贝尔化学奖 1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶链反应（PCR） 最初采用E-coli DNA聚合酶进行PCR，由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错 耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行，随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪 1993年度诺贝尔化学奖

Kary Mullis 1972在加州大学伯克利分校取得博士学位，专长有机合成; 1975堪萨斯州医学院心脏科找到工作。实验需要宰杀许多老鼠。 1979年，穆里斯进入 “西特斯”（Cetus）的私人生物技术公司任职。 1983年春天，他带女友前往乡间的小屋度周末。在蜿蜒的乡间公路上开着车，一段DNA反复复制的景像，在他的脑海里冒出来。穆里斯原以为这是简单的想法，但搜索文献后却发现没有。该年8月，穆里斯首次在公司里正式作了有关PCR原理的报告，听者反应冷淡。 第一篇提到PCR这个方法的论文，日裔技术员才木于1985年12月发表在《科学》周刊上，共有七位作者，才木 排头名，穆里斯则排第四。 1987，《Methods of Enzymology》，主要是因为有人与该刊主编吴瑞相熟。于是，穆里斯的文章终于得到发表，到1987年初才问世。 西特斯的主管向冷泉港实验室的沃森推荐穆里斯在1986年5月举行的“人类分子生物学” 研 讨会，报告PCR的原理及应用结果。这是穆里斯生平第一次受邀演讲，建立了往后人们的印象： PCR是穆里斯一手发明的。

Principle for PCR 类似于DNA的体内复制。首先待扩增DNA模板加热变性解链，随之将反应混合物冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发生退火，再将温度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环，PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复。

Principle for PCR Template denaturatation Primer annealing Primer extension Primer: DNA合成时结合在模板上为合成提供3‘-OH的寡核苷酸片段 重复1~3步25~30轮; 目的DNA片段扩增100万倍以上

下载自Dolan DNA learning center Principle for PCR 动画观看 下载自Dolan DNA learning center (www.dnalc.org)

Curve of PCR Reaction

PCR的实验过程 配置反应液 PCR 反应 上样 电泳 成像

PCR Reaction System 10×扩增缓冲液 10ul 4种dNTP混合物 各200umol/L 引物 10～100pmol 模板DNA 0.1～2ug Taq DNA聚合酶 2.5u Mg2+ 1.5mmol/L 加双或三蒸水至 100ul 体系可根据比例缩减或增加

Principle for Primer Design (1) ①引物长度： 15-30b，常用为20b左右 引物的有效长度不能大于 38b，否则最适延伸温度会超过TaqDNA聚合酶的最适温度（74℃），不能保证PCR扩增产物的特异性 ②引物扩增跨度：以500b为宜 特定条件下可扩增长至10kb的片段 ③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜 G+C太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带 ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列

Principle for Primer Design (2) ④避免引物内部出现二级结构 避免两条引物间互补， 特别是 3’端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异性的扩增条带 ⑤引物 3’端的碱基要求严格配对 特别是最末及倒数第二个碱基，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败 ⑥引物中有或能加上合适的酶切位点 被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处

Taq DNA Polymerphase Taq DNA聚合酶是从Thermus aquaticus菌提取的热稳定性酶，分子量大约为94kDa。这种酶的天然形式可在74 ℃复制DNA，在95℃的半衰期为40分钟。Taq DNA聚合酶在镁存在的条件下可催化核苷酸沿5'-3'方向发生聚合反应，形成双链DNA；同时它还具有5'-3'外切酶活性。该菌是1969年从美国黄石国家森林公园火山温泉中分离的.

Taq DNA Polymerphase 离子需要：对Mg2+、单价离子性质和浓度较 敏感。最适浓度为50mmol/L。 忠实性:没有校正单核苷酸错配功能--致命弱点。一般出错率为2×10-4核苷酸/每轮循环，利用PCR克隆、测序时尤应注意。

Taq DNA Polymerphase 抑制剂:尿素、乙醇、DMSO、甲酰胺、SDS及许多其他化学药剂。 内源DNA:不同来源的酶可能由于制备过程中残留的原细菌DNA或PCR产物的污染而含有不明来源的DNA。在使用扩增保守序列的通用引物时，会在无模板对照管出现扩增带。 保存:在-20℃至少6个月。

Quality and Concentration of dNTP dNTP的质量与浓度和 PCR扩增效率有密切关系 在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等（等摩尔配制 ）， 如其中任何一种浓度不同于其它几种时（偏高或偏低），就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量 dNTP 能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低

Template（target gene） 对模板DNA质量的要求因标记的种类不同而有所差异，一般说来基于RFLP（酶切）的标记对DNA质量要求很高，而PCR标记对模板DNA质量要求并不很高，主要防止Taq酶抑制剂污染。

Concentration of Mg2+ Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响 在一般的 PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0 mmol/L为宜 Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增， 浓度过低会降低 Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少

Optimization of PCR reaction 温度 时间 循环次数

Temperature & Time Setting 设置变性-退火-延伸三个温度点 标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40 ～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸 对于较短靶基因（长度为100～300bp时）可采用二温度点法， 将退火与延伸温度合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸

Primer Annealing Temperature Tm值（解链温度）=4（G+C）＋2（A+T） 复性温度=Tm值-（5～10℃） 在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性 复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合

Extensions Temperature & time 延伸温度：一般选择在70～75℃之间 常用温度为72℃ 过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。 延伸反应时间：根据待扩增片段长度而定 1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min（足够） 3～4kb的靶序列需3～4min 扩增10Kb需延伸至15min 延伸进间过长会导致非特异性扩增 对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些

Cycle Numbers 循环次数 决定PCR扩增程度 主要取决于模板DNA的浓度 循环次数：选在30～40次之间 循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多

Advantages of PCR 特异性强 灵敏度高 简便、快速 对标本的纯度要求低

Factors Effecting PCR Speciality 引物与模板DNA特异正确的结合； Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性； 靶基因的特异性与保守性. 最佳反应体系及扩增程序

High Sensitivity PCR 产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克 ( pg=10-12 ) 量级的起始待测模板扩增到微克( ug=10-6)水平 从 100 万个细胞中检出一个靶细胞 在病毒的检测中，PCR 的灵敏度可达 3 个RFU (空斑形成单位) 在细菌学中最小检出率为3个细菌

Simple and quickly PCR反应用耐高温的 Taq DNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在DNA 扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应，一般在2-4 小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广

PCR-based Markers RAPD, SSR, etc.

PCR Based Marker—RAPD 发明：是 Williams 等人于 1990 年首创的一种 DNA 技术，被称为 Random amplification of Polymorphic DNA (随机扩增的多态性DNA） 原理：以 PCR 为基础 , 利用人工合成的约 10 bp的随机序列寡核苷酸作引物 , 以生物的基因组 DNA 为模板 , 进行 PCR 扩增 , 产生不连续的 DNA 产物 , 通过琼脂糖凝胶电泳来检测 DNA 序列的多态性。 RAPD 反应的循环次数可多达 40—50次 , 每次循环中 , 双链 DNA 在 95℃的高温下变性 , 解开双螺旋成为单链模板 , 然后在低温 (36 ℃) 条件下与随机引物结合 , 在 DNA 多聚酶的作用下，按碱基互补原则沿 5‘至3’的方向把核苷酸链延长，完成 DNA 复制。如此反复数十次 , 可以使单一的 DNA 序列扩增 105-107 倍。

Principle of RAPD

RAPD操作 PCR反应体系： DNA（20ng/µl） 1µl Primer 15ng 10×Buffer 2.0µl Mg2+（25mM） 1.2µl Taq酶（5U/µl） 0.15µl dNTP（25mM） 0.2µl 加水至20µl，再加入石腊油，进行PCR扩增。

PCR扩增程序： Step1 95℃ 2分钟 Step2 95℃ 15秒 Step3 36℃ 30秒 Step4 72℃ 45秒 RAPD PCR扩增程序： Step1 95℃ 2分钟 Step2 95℃ 15秒 Step3 36℃ 30秒 Step4 72℃ 45秒 Step5 GOTO Step2 46循环 Step6 72℃ 5分钟  

RAPD

RAPD标记 特征： ① 引物很短（10 base） ② 只有1种引物参与反应 ③ 引物在染色体上随机结合 ④ 退火温度低一般为35-37℃ ⑤ 当两引物在互补的模板DNA链上的结合位点距离小于2000 bp 便可扩增出该区域。

RAPD标记 优点： --实验步骤少，省工、省力、进度快 --不需先知道基因组的任何分子信息 --所用材料不需有性世代，可用任何单一亲本 --引物具有广泛性和通用性。 缺点： RAPD 是一种显性标记 , 不能区分纯合子与杂合子；易受实验条件的影响 , 表现为扩增产物的稳定性差。

SSR标记 SSR: Simple Sequence Repeat，简单重复序列，又称微卫星DNA （microsatellite）或短的串联重复（Short Tandem Repeat, STR)。 微卫星DNA：一类由几个核苷酸（一般1-5个，基序很短）为重复单位串联而成的DNA序列。微卫星DNA广泛存在于真核生物中，人和动物（TG）n，植物（AT)n微卫星DNA长度的多态性;微卫星DNA两端多是高度保守的单拷贝序列。

微卫星DNA的类型 单核苷酸重复(Mononucleotide ) (A)11 AAAAAAAAAAA SSR 微卫星DNA的类型 单核苷酸重复(Mononucleotide ) (A)11 AAAAAAAAAAA 2、 二核苷酸重复(Dinucleotide) (GT)6 GTGTGTGTGTGT 3、 三核苷酸重复(Trinucleotide) (CTG)4 CTGCTGCTGCTG 4、 四核苷酸重复(Tetranucleotide) (ACTC)4 ACTCACTCACTCACTC 不同物种其重复序列及重复单位频率不同。 通过对54个植物种核DNA和28个植物种细胞器DNA SSR(1-4bp)的搜索,发现：(AT)ｎ最丰富,然后依次是: (A)n、(T)n、(AG)n、(CT)n、(AAT)n、(ATT)n、(AAC)n、(GTT)n、(AGC)n、(GCT)n、(AAG)n、(CTT) n、(AATT)n、(TTAA)n、(AAAT)n、(ATTT)n及(AC)n、(GT)n。 同一类内碱基种类不同的SSR,丰度差别很大。

Types of Microsatellites SSR Types of Microsatellites Homozygous …CGTAGCCTTGCATCCTTCTCTCTCTCTCTCTATCGGTACTACGTGG… 5’ flanking region microsatellite locus 3’ flanking region Heterozygous …CGTAGCCTTGCATCCTTCTCTCTCTCTCTCT ATCGGTACTACGTGG… …CGTAGCCTTGCATCCTTCTCTCTCTCTCTCTCTCTATCGGTACTACGTGG…

Principle of SSR 根据两端序列的保守性设计引物进行PCR，电泳分离，染色显带以检测微卫星序列多态性。 多态性好、重复好、共显性标记

Where Are Microsatellites？ SSR Where Are Microsatellites？ Majority are located in non-coding region

SSR marker Development 基于DNA文库

SSR marker Development 基于生物信息学 1 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110

Procedures for SSR SSR操作与RAPD的主要不同之处在于： 使用的是引物对，每条引物长度在18 —25 base之间。 退火温度一般在50—60 ℃ 扩增循环数在25—35之间 检测方式有琼脂糖胶或PAGE 胶两种

SSR Marker Applied in Citrus SSR引物TAA1在柑橘属及其近缘属29个样品中的扩增带型

SSR标记的优点 约50%呈多态性 共显性 数目多且在基因组中均匀分布 多数位点呈选择中性，符合群体遗传学了理论 技术上适合用PCR分析半自动化，结果可靠 部分降解的DNA样品也可用 适合于等位酶变异小的居群水平的研究

SSR SSR标记的缺点 可用的位点数目少 设计引物的费用高，耗时长 物种专一性 在说明群体分化和物种分化时可能产生错误

Restriction and PCR Combined Marker—AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism 54

Brief on AFLP 荷兰Zabeau和Vos1992年发明 结合了RFLP和PCR技术的特点，具有RFLP技术的可靠性和PCR技术高效性。 它将RAPD随机性和专一性扩增巧妙结合，再选用内切酶以达选择的目的。

AFLP Principle of AFLP 基本原理：对基因组DNA进行酶切，连上双链人工接头，根据接头的核苷酸序列和酶切位点设计引物，进行选择性扩增。它将RAPD随机性和专一性扩增巧妙结合，再选用内切酶以达选择的目的。

AFLP Principle of AFLP ① DNA 双酶切 + 接头 ② 预扩增 ③ 选择性扩增