微生物实验 实验一 显微镜的使用及微生物形态观察 实验二 活性污泥生物相及藻类形态观察 实验三 微生物的染色 实验四 微生物细胞数的计数 实验一 显微镜的使用及微生物形态观察 实验二 活性污泥生物相及藻类形态观察 实验三 微生物的染色 实验四 微生物细胞数的计数 实验五 活性污泥不同微生物种群的分离培养与鉴别

实验一 显微镜的使用及微生物形态观察 一. 目的 2. 观察蓝细菌、霉菌、酵母菌、放线菌的个体形态，学会生物图的绘制。 二. 实验器材 实验一 显微镜的使用及微生物形态观察 一. 目的 1. 了解普通光学显微镜的构造，学习显微镜的使用方法和保养。（高、低倍镜的使用） 2. 观察蓝细菌、霉菌、酵母菌、放线菌的个体形态，学会生物图的绘制。 二. 实验器材 1. 光学显微镜 2. 示范片：颤藻、曲霉、青霉、酵母菌、放线菌。 1-1

机械部分: 镜筒(双筒，两筒间距离可调，上装有目镜） 转换器（3孔，装有物镜） 载物台（中央圆孔、弹簧夹、移动器） 调节器（粗调、细调） 三. 实验内容 (一) 显微镜的构造和使用方法 1. 构造 机械部分: 镜筒(双筒，两筒间距离可调，上装有目镜） 转换器（3孔，装有物镜） 载物台（中央圆孔、弹簧夹、移动器） 调节器（粗调、细调） 镜臂（支撑作用） 镜座（上有光源，亮度可调） 光学部分：目镜（10×、16×） 物镜（低倍镜10×、高倍镜40×、油镜100×） 聚光器（内有光圈调节） 光源（光量可调） 1-2

显微镜放大倍数 = 目镜放大倍数 × 物镜放大倍数 物镜上的标识： 1. 25 (0. 65、0 显微镜放大倍数 = 目镜放大倍数 × 物镜放大倍数 物镜上的标识： 1 .25 (0.65、0.25) 100(40、10） 160 / 0.17 ↓ ↓ ↓ ↓ 数值孔径 放大倍数 镜筒长 盖玻片厚度 数值孔径： N.A. = n﹒s i n α/ 2 n — 玻片和物镜之间的折射率。 α— 光线最大射入角。 分辨率（最大可分辨距离）＝λ/ N.A. λ—波长 1-3

2. 显微镜的使用 低倍镜的使用 （1）双手取出显微镜置于实验台上，接上电源，打开开关，调节合适光量。 （2）转动转换器，将低倍镜移至正下方。调节两目镜镜筒间的距离。 （3）将载玻片放在载物台上夹住，移动观察对象于圆孔正中。 （4）侧视物镜，转动粗调将载物台上移，至载玻片距物镜头约５ｍｍ时停止。 （5）双眼向目镜里观察，同时旋转粗调节器使载物台缓慢下移，若标本显出但不清晰，可用细调节器调至清晰。若粗调旋转太快，超过焦点没有看到标本，则必须重复（4）、 (5)步骤。不能在眼睛观察目镜的同时旋转粗调，以防物镜与载玻片相碰撞，造成损坏。 1-4

高倍镜的使用 在用低倍镜找到观察目标后，若需要进一步放大观察，将其移到视野中央。用转换器将高倍镜移到镜筒下方，将光量调大一点。若标本不清晰，用细调上下转动使之清晰。（此时不再动粗调） ３．显微镜的维护 （１）将载物台降至最低，取下标本片。 （２）将光量调至最小，关上电源。 （３）用镜头纸先檫目镜、物镜，再擦显微镜其它部分。 （４）将显微镜放入镜箱，还原。 1-5

（二）微生物形态的观察 1. 用低倍镜和高倍镜观察颤藻、曲霉、青霉、酵母菌、放线菌、星藻示范片。 2 （二）微生物形态的观察 1. 用低倍镜和高倍镜观察颤藻、曲霉、青霉、酵母菌、放线菌、星藻示范片。 2. 画出微生物形态图，并标明显微镜的放大倍数。 10 ╳ 10 颤藻 1-6

实验二 活性污泥生物相的观察 一. 目的 二. 实验器材 1. 学习测量微生物大小。 2. 学习用压滴法制作标本片。 实验二 活性污泥生物相的观察 一. 目的 1. 学习测量微生物大小。 2. 学习用压滴法制作标本片。 3. 观察几种原、后生动物，菌胶团形态。 二. 实验器材 1. 活性污泥混合液。 2. 显微镜、载玻片、盖玻片。 3. 目测微尺、物测微尺。 2-1

三. 实验内容 1. 微生物大小的测定 (1) 标定目镜测微尺 1. 微生物大小的测定 (1) 标定目镜测微尺 装在目镜上的目测微尺中央刻有等分为100格或更多格的标尺，使用前要用物测微尺标定。物测微尺中央刻有1mm长的标尺，等分为100格，10μm／格。将物测微尺的刻度朝上放在载物台上，用低倍镜找出物测微尺的刻度，移动物测微尺使其第一条线与目测微尺的第一条线重合，顺着刻度线找出另一条重合线。算出低倍镜下目测微尺每格的长度。换高倍镜用同样方法标定出高倍镜下目测微尺每格的长度。 2-2

测微尺示意图 (2) 微生物大小的测量 　　 将物测微尺取下，换上标本片，选择适当物镜测量微生物的长度和宽度占目测微尺的格数，再按目测微尺1小格的长度换算出微生物的长度和宽度。 2-3

2.压滴法观察活性污泥中生物相 （1）压滴法制作标本片 用滴管取活性污泥混合液一小滴，放在载玻片中央。取一块盖玻片先将一边与混合液接触，然后慢慢将盖玻片放下使其盖在混合液上。片内不能有气泡。 （2）观察活性污泥中生物相 先用低倍镜观察活性污泥中菌胶团、原生动物、后生动物。画出所观察到的生物形态图。标明名称、放大倍数和微生物的大小。 2-4

四. 实验结果 1. 标出低、高倍镜下目测微尺每小格的长度（um/格）。 2 四.实验结果 1.标出低、高倍镜下目测微尺每小格的长度（um/格）。 2.画出3种污泥中所观察到的生物形态图。标明名称、放大倍数和微生物的大小（um）。 2-5

实验三 微生物的染色 一. 目的 1. 学习微生物的染色技术，掌握微生物的单染色法和革兰氏染色法。 2. 学习油镜的操作。 3-1

二．染色原理和油镜的工作原理 1．油镜工作原理 因折射或反射而 不能进入 镜头。物象就显 现不清。 为了不使通过的 光线有 油镜的放大倍数最大（100），故镜头焦距短，直径小,但所需光照强度却最大。从标本片透过的光线是从玻片进入空 气，再进入镜头。由于玻璃和空气的介质密度不同，有些光会 因折射或反射而 不能进入 镜头。物象就显 现不清。 为了不使通过的 光线有 所损失，须在油镜与玻片 之间加入折射率和玻璃 (n=1.52）相仿的香柏油 (n=1.515)。故而称之为 “油镜”。

2．单染色法原理： 微生物不但个体微小，且无色半透明。要在显微镜下观察清楚，必须染上颜色 。微生物细胞中含有大量的蛋白质等一类两性电解质：在酸性溶液中结合质子带正电；在碱性溶液中给出质子而带负电。等电点一般在pH=2~5。所以，在中性、碱性或弱酸性溶液中，微生物细胞通常带负电荷。碱性染料在电离时，染色部分是带正电荷的，容易与带负电荷的菌体结合使之着色。经染色后的菌体细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下很容易观察。 3-2

3．革兰氏染色法原理： 细菌分为G＋和G- ，这由两类细菌细胞壁的结构和组成的不同而决定。用结晶紫初染后，所有的细菌都染上蓝紫色。碘作为媒染剂能与结晶紫结合形成结晶紫-碘的复合物，增强了染料与菌体的结合力。用乙醇脱色处理时，两类细菌脱色效果不同。G＋菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成，且壁厚、类脂含量低，用乙醇脱色时使细胞壁脱水、网状结构孔径缩小，通透性降低，使结晶紫—碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内。复染后仍然保持初染剂的蓝紫色。G-菌由于其细胞壁肽聚糖层较薄，类脂含量高，所以在脱色时，类脂被乙醇溶解，细胞壁的通透性增大，使结晶紫—碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的颜色。 3-3

三．实验器材 1．显微镜、香柏油、接种环、酒精灯等。 2．结晶紫染液、卢戈氏碘液、95%乙醇、沙黄（番红）染液。 3．菌种：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌。 3-4

四．实验内容 (一) 单染色 1．涂片 取一块载玻片，用记号笔划分出两区域并做上记号，在两区域中央各滴半滴无菌水，用接种环以无菌操作法分别取两种菌种在左右两滴水中，和匀后涂成薄膜。 2．干燥 室温自然干燥或吹干。 3．固定 涂面朝上，通过火焰2~3次。 4．染色 在涂片薄膜上滴加结晶紫染液，使之覆盖2分钟。 5．水洗 傾倒去染液，斜置载玻片，用洗瓶小水流沿玻片边缘冲洗，直至水呈无色为止。 6．干燥 室温自然干燥或用吸水纸吸干。 3-5

7. 媒染 加媒染剂碘液使之覆盖1分钟，水洗，吸水纸吸干。 (二)革兰氏染色 完成单染色的1~6步骤后 7. 媒染 加媒染剂碘液使之覆盖1分钟，水洗，吸水纸吸干。 8. 脱色 滴加95% 乙醇数滴使之覆盖16秒钟，立即水洗,吸干。 9. 复染 用沙黄（番红）液复染 2 分钟，水洗，吸干。 3-6

(二) 镜检 油镜用完后，用镜头纸沾取乙醇-乙醚混合液擦拭油镜头。再用干的镜头纸擦干镜头。 (二) 镜检 先分别用低倍镜和高倍镜找到要观察的样品区域后，用转换器将物镜转到空挡，在样品区域滴加香柏油，再将油镜慢慢转到工作位置浸入油中。若不清晰，慢慢转动微调直至清楚。 油镜用完后，用镜头纸沾取乙醇-乙醚混合液擦拭油镜头。再用干的镜头纸擦干镜头。

五．实验结果 观察两种细菌的形态和颜色，绘出油镜下细菌形态图，说明革兰氏染色的结果。 六．思考题 五．实验结果 观察两种细菌的形态和颜色，绘出油镜下细菌形态图，说明革兰氏染色的结果。 六．思考题 通过实验，你认为革兰氏染色成功关键是那一步？为了避免假阳性或假阴性出现，在对未知菌种做革兰氏染色鉴定时，你认为应该怎样做？ 3-7

实验四 微生物的计数 （显微镜直接计数法） 2.观察酵母菌的形态，学习区分酵母菌死活细胞的方法。 实验四　微生物的计数 （显微镜直接计数法） 　　 一．目的 　　 1.了解血球计数板的计数原理，掌握血球计数板的计数方法。 2.观察酵母菌的形态，学习区分酵母菌死活细胞的方法。 二. 实验器材 显微镜、血球计数板、酵母菌液、美蓝染液、盖玻片。 4-1

　 三．原理 1. 血球计数板计数原理 　　 血球计数板是一块特制的载玻片，有四条竖槽和一条横槽。横槽两边的平台上各有一个有九个大方格的方格网，中间大方格为计数室：边长为１ｍｍ，深为0.1mm，容积为0.1mm3(10-4ml)。计数室有两种规格：一是分为16个中方格，每中方格中有25个小方格；另一种是分为25个中方格，每中方格有16个小方格。两种都共有400个小方格。 4-2

计数： 数出5个中方格中的总菌数A，若菌液的稀释倍数为B，则计算公式如下： (1) 25个中方格的计数板计算公式 (2) 16个中方格的计数板计算公式 4-3

2. 区分酵母菌死活细胞基本原理 美蓝是一种无毒性的染料，它的氧化型呈蓝色，还原型是无色。用美蓝对酵母菌的活细胞进行染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝由蓝色的氧化型变成无色的还原型。因此，具有还原能力的酵母活细胞是无色的或淡蓝色，而死细胞或代谢作用的衰老细胞则呈蓝色，借此即可对酵母菌的死细胞和活细胞进行鉴别。

四. 实验内容 1. 酵母菌的形态观察及死活细胞的鉴别 (1) 在载玻片上加半滴美蓝染液，在染液上滴一滴菌液。取一块盖玻片，先将一边与菌液接触，然后慢慢将盖玻片放下盖在菌液上。 (2) 将标本片放3分钟后，先用低倍镜然后用高倍镜观察酵母菌的形态和出芽情况，并根据颜色来区别死活细胞。

(2) 加样品 在血球计数板上盖上盖玻片, 用滴管将摇匀的酵母菌液由盖玻片边的小槽滴一小滴,菌液会自动进入计数室，静置5分钟。 　 2. 酵母菌液的计数 (1) 镜检计数室 对计数板进行镜检。若有污物，则用自来水冲洗，用电吹风吹干后 才能 进行计数。 (2) 加样品 在血球计数板上盖上盖玻片, 用滴管将摇匀的酵母菌液由盖玻片边的小槽滴一小滴,菌液会自动进入计数室，静置5分钟。 (3) 计数 将血球计数板置于载物台上，先用低倍镜找到计数室的位置，再换高倍镜计数。每计数室计5个中格（四角和中间）。计数原则：计上不计下，计左不计右。芽体占母细胞一半时算一个。 (4) 清洗血球计数板 计数后将血球计数板用自来水冲洗干净，勿用硬物刷，吹干后镜检。若不干净，则必须重复洗涤干净为止。 4-4

五. 结果记录 1. 2.酵母菌的生物图和死活细胞的比例。 六. 思考题 用此法计数的结果是活菌体还是死、活菌体的总和？ 4-5

实验五活性污泥不同微生物种群的分离培养与鉴别 一. 目的 1．掌握配制培养基和制备无菌水的方法。 2. 学会玻璃器皿的干热灭菌和培养基高压蒸汽灭菌技术。 3. 学习倒平板的方法和两种分离微生物的基本操作技术。 4. 学习微生物分离、培养、初步鉴别及菌落的观察。 5-1

二. 实验器材 1.培养皿、试管、吸管、锥形瓶等。 2.牛皮纸等包扎材料。 3. 10% HCl、10% NaOH、精密pH试纸。 二. 实验器材 1.培养皿、试管、吸管、锥形瓶等。 2.牛皮纸等包扎材料。 3. 10% HCl、10% NaOH、精密pH试纸。 4.牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖、 NaCl、K2HPO43H2O、MgSO47H2O、FeSO47H2O、KH2PO4、1%孟加拉红、10%苯酚、链霉素、琼脂/结晶紫染液等。 5. 高压蒸汽灭菌锅等。 6. 活性污泥。 7．接种环、酒精灯、恒温箱(培养箱)等。 8．显微镜、载玻片。

三. 实验内容 （一）培养基的制备及灭菌 1. 玻璃器皿的包扎与灭菌 （1） 六套培养皿一组, 用报纸包装。 三. 实验内容 （一）培养基的制备及灭菌 1. 玻璃器皿的包扎与灭菌 （1） 六套培养皿一组, 用报纸包装。 （2） 取四支吸量管，用长报纸条包扎。 （3） 干热灭菌:上述玻璃器皿在160°C烘箱内2小时。 2.无菌水的制备 在3支试管中各装入9ml自来水，塞上硅胶塞, 同下述培养基一起用高压蒸汽灭菌。 5-2

3. 培养基的制备（选一种） 牛肉膏蛋白胨培养基配方： 牛肉膏 蛋白胨 氯化钠 琼脂 自来水 pH 0.75g 2.0g 1.0g 4.0g 200ml 7.4~7.5 高氏1号培养基配方： 可溶性淀粉 NaCl KNO3 K2HPO4 MgSO4 FeSO4 琼脂 水 pH 4g 0.1g 0.2g 0.002g 3~4g 200ml 7.4 马丁氏培养基的配方： KH2PO4 MgSO4 蛋白胨 葡萄糖 1/3000孟加拉红 琼脂 水 pH 0.2g 0.1g 1g 2g 20ml 3~4g 160ml 自然 5-3

[1]配制溶液 ： 按培养基的配方，称取各种原料。将上述各物依次加入烧杯（高氏1号培养基先将淀粉用一个小烧杯调成糊状，再加入所需水量的沸水中，加热使淀粉完全溶化，再将其它成分依次溶化 ），在电炉上加热溶解时应不断搅拌以防原料在杯底烧焦。注意补充水。 [2] 调pH值： 溶液稍冷后用pH试纸、10% NaOH或10%HCl 调整溶液 pH。 [3] 分装：试管4支各装其高度1/5的溶液，其余溶液装锥形瓶。 [4] 加塞包扎 ：锥形瓶加棉塞并用牛皮纸包扎。 [5] 湿热灭菌 ： （高压蒸汽灭菌）1.05kg/cm2(103kPa)、 121℃灭菌 20min。 [6] 搁置斜面： 试管培养基冷至50℃时斜搁使斜面长度不`超过试管一半。

（二）微生物的分离、培养及形态观察 1. 平板划线分离法 (1) 倒平板: 将融化并冷至50℃的细菌培养基（向高氏1号培养基中加入10%的苯酚几滴；向马丁氏培养基中加入0.03%链霉素溶液20毫升）倒约15~20ml于无菌培养皿中，立即放在桌上轻轻转动使之均匀。冷后成平板。（3个） (2) 划线：在火焰旁，左手拿平板，右手拿接种环，取一环菌液（原污泥）在平板上划线。常用的方法有如下三种： 划线完毕后盖上皿盖，平板 倒置于37℃恒温箱中培养1~2天 （高氏1号和马丁氏培养基于 28℃恒温箱内培养3~5天）后观察结果。 6-1

2.稀释平板分离法 (1) 取样 … (2) 稀释水样 以无菌操作按十倍稀释法用无菌吸量管和无菌水将10-3倍的水样稀释至10-4、10-5、10-6倍。 (3) 平板制作 将三套无菌培养皿编号，将上述三种浓度的水样各吸0.5ml 于相应的培养皿中。加热融化培养基，待其冷至约45℃时以无菌操作倾注10~15ml 入培 养皿中，马上将培养皿平 放桌上 轻轻转 动使之混合均匀， 冷却后 成平板。 倒置，于 37℃培 养1-2天（高氏1号和 马丁氏培养基于 28℃培养3~5天） 后观察结果。 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 6-2

3．菌落形态特征的观察 4．微生物个体形态观察 观察平板上菌落的形态、结构、大小、菌落高度、颜色、透明度、气味及粘滞性等。 选定2个菌落。分别涂片，干燥后固定，用结晶紫染色，干燥后用油镜观察。并绘制形态图。 5. 纯种培养 在培养好的平板上选定一个 典 型的菌落。将接种环在火焰上 灼烧灭菌。以无菌操作法轻轻挑取 少许菌种，迅速将接种环伸进斜面 试管中，在培养基上由底部向顶部 轻轻划线。试管塞好塞子，在37℃ 培养1天（高氏1号和马丁氏培养基于28℃培养3~5天）后观察。 6-4

你从活性污泥中分离出几种微生物，属哪个微生物类群？描述选定的2种菌落的形态特征，画出2种微生物的个体形态。 四. 实验结果： 你从活性污泥中分离出几种微生物，属哪个微生物类群？描述选定的2种菌落的形态特征，画出2种微生物的个体形态。 五.思考题： 1. 为什么干热灭菌比湿热灭菌所需要的温度高、时间长？ 2. 培养基配好后，为什么必须立即灭菌？ 3. 分离活性污泥为什么要稀释水样? 你考虑怎样来进行生物膜法中生物膜的纯种分离和培养?