第三章 微生物 代谢调节

第一节 代谢调节部位 发酵：通过微生物的培养，使某种特定的代谢产物积累的过程。 代谢控制：利用遗传学或其他生化方法，人为的在DNA水平上来改变和控制微 生物的代谢，使得有用的产物大量积累的发酵称为代谢控制发酵。 第一节 代谢调节部位 一、原核生物 （1）溶质摄入 （2）酶活力 （3）酶或透酶的合成

二、真核微生物 （1）溶质摄入 （2）酶活力 （3）核内转录 （4）细胞质中转译（5）代谢物摄取和脱离细胞器 三、微生物的代谢调节方式 （1）通道：细胞膜对多数亲水分子起屏障作用，受ATP（透酶）影响，也受透酶活性的调节。 （2）通量的控制：有调节现有的酶量（通过增加或减少途径中关键酶的合成或降解速率）和改变酶的活性。 （3）限制其基质有形的接近：在真核生物中基质仅存在于分隔的各个代谢库中。这些代谢库位于各种细胞膜包裹的细胞器内。

第二节 M代谢调节的生化基础--酶合成的调节 DNA指导酶的合成，环境不影响M的DNA，但影响到DNA的表达，M依靠其代谢调节机制，任凭环境起多大变化，M一般不过量合成代谢物。 一、诱导作用 ●定义：生物与一种化学物质--诱导物接触的结果大大地增加了酶合成的速度。基质的结构类似物是出色的诱导物，但不能作为基质。 ● 酶的产生形式：诱导型和组成型。 ● 诱导系数：酶合成的诱导速率与非诱导速率之比。

(1)、诱导作用分子水平机制

(2)、顺序诱导作用 β—半乳糖苷酶 水解乳糖成葡萄糖 和半乳糖

(3)、诱导物的种类与效率

(4)、诱导调节的克服 强力因素诱变引起的突变，突变在调节基因或操纵基因上，从而导致调节基因编码合成的阻遏物无活性或操纵基因对活性阻遏物的亲和力衰退，则无需诱导物便能生产诱导酶。 这种突变作用称为调节性或组成型突变，具有这种特性的菌株称为组成型突变株。 (5)、组成型突变株的获得、富集方法 在诱导物为限制性基质的恒化器中筛选：如一亲株经诱变的群体生长在含有很低浓度的诱导物的恒化器中，这会有利于不需诱导物的组成型突变株的生长。那些由于诱导物浓度很低而生长缓慢的亲株被恒化器逐渐淘汰。故恒化器起到一种富集组成型突变株的作用。

将菌株轮番在有、无诱导物的培养基中培养：在第一个生长周期在含葡萄糖的培养基中极少量的组成型突变株与占绝对优势的亲株将以同样的速率生长。然后将此混合培养物移种到以乳糖为唯一碳源的培养基中，这将有利于组成型突变株的生长；未突变的亲株需要诱导半乳糖苷酶的合成，因而经较长的停滞期才开始生长。每次移种到含有葡萄糖的培养基后会使亲株的β-半乳糖苷酶合成立即停顿，再移种到含乳糖的培养基中亲株又需经一段停滞期后才能开始生长。因此重复交替上述培养过程，最终会使组成型突变株占优势。 使用诱导性能很差的基质 ：如将经诱变的群体生长在一种能作为碳源、但不能作为诱导物或其诱导性能很差的基质上，便可筛选出组成型突变株。 使用阻碍诱导作用的抑制剂 ：有些化合物会阻碍一些酶的诱导作用。

二、分解代谢物阻遏 1、定义：培养基中某种基质的存在会减少（阻遏）细胞中相应酶的合成速率。如葡萄糖、精氨酸等受分解代谢物阻遏的酶.

2、分解代谢物效应 将大肠杆菌培养在含有两种的碳源的培养基里，便会出现两阶段生长。其特征是两个对数生长期之间夹有一段明显的停滞期。在第一个生长期间菌利用葡萄糖，在第二个生长期内利用乳糖。第一个生长期内乳糖代谢所需的酶未被合成，直到培养基中葡萄糖被耗竭。 代谢期间β-半乳糖苷酶和半乳糖苷透酶的诱导作用被葡萄糖阻止。这种酶诱导阻遏作用起先被认为只限于葡萄糖，因而称为葡萄糖效应。随后的工作表明，所有可迅速代谢的能源都阻遏异化另一被缓慢利用的能源所需酶的形成，故称这一现象为分解代谢的阻遏作用。分解代谢物阻遏的结果：细胞总是先利用维持最迅速生长的基质。

3、分解代谢物阻遏的分子机制 抑制 葡萄糖分解过程中的中间产物抑制CAMP 的合成，加速其分解， CAMP浓度降低，使复合物浓度随之降低，对于RNA聚合酶起不到应有的激活作用。

4、耐分解代谢物阻遏的突变株的获得 (1)、用强力因素诱变与适当的筛选方法可得 原理：以一种能引起分解代谢物阻遏的基质作唯一N源，用含此N源的平板培养筛选经诱变的菌株(如产气杆菌的组氨酸酶受葡萄糖的阻遏，将菌株诱变后培养在含葡萄糖和组氨酸（无其他氮源）的培养基，可筛选不受葡萄糖阻遏的组氨酸酶突变株。） (2)、轮番让菌株在含葡萄糖和不含葡萄糖的培养基上生长。

三、反馈调节 包括：反馈抑制和反馈阻遏 ●反馈抑制：是一生物合成途径的最终代谢物抑制那一途径的前面第一或第二个酶的活性。 ●反馈阻遏：终产物或其结构类似物阻止了催化途径中一个或几个酶的合成。 1、反馈阻遏在分子水平上的作用机制

a 辅阻遏物与阻遏物蛋白结合成 阻遏物，阻碍转录的进行 b 无辅阻遏物时，阻遏蛋白不起作用，RNA聚合酶沿DNA分子链移动，把结构基因转录到mRNA上

酶a 酶b (酶c)—3 酶d A B C D E 反馈抑制 阻遏 3 ---此突变株缺少酶c 2、反馈调节作用的消除 (1)、常用限制末端产物(抑制性或阻遏性)在胞内积累的方法。 原理：如需要生产中间产物C，首先要获得一缺少酶c的营养缺陷型突变菌株。这种突变菌株不能合成E，但需要E来维持生长，E反馈抑制酶a并阻遏酶a与b的合成。如果供给低浓度的E，其量控制在不足于引起抑制或阻遏反应a和b的程度，这样便能过量合成C，并将其分泌到培养基内。 酶a 酶b (酶c)—3 酶d A B C D E 反馈抑制 阻遏 3 ---此突变株缺少酶c C

上述原理也适用于带支路的合成途径合成有价值中间产物的生产，如肌苷酸的生产。

(2)、避开末端代谢产物的反馈调节作用方法 ● 控制培养基的成分

● 加入生物合成途径的抑制剂 ● 限制补给营养缺陷型突变株所需的生长因子 ● 采用末端代谢产物的衍生物：限量供给

3、分离耐末端代谢产物调节的突变株的方法 (1)、将经诱变处理过的野生型菌株涂布在含有末端代谢产物的结构类似物的平板上，培养一段时间大多数细胞被杀死，而那些发生了抗性突变的菌株则形成菌落，从而得到不受末端代谢产物调节作用的突变株。 机制：在正常情况下，细胞中过量末端代谢产物(如氨基酸A)会抑制和阻遏参与其生物合成途径的酶。氨基酸A可用于蛋白质的合成，氨基酸类似物A´(又称抗代谢物)，具有与氨基酸A一样的调节作用，但不能用于合成蛋白质。经诱变处理的野生型菌株在含有氨基酸类似物A´的培养基中培养时，因为绝大多数细胞不能合成氨基酸A而死亡只有那些对类似物A´不敏感的抗性突变菌株能合成氨基酸A，方能形成菌落。在这些突变菌株中，有些可能是由于参与氨基酸合成的酶结构起了变化，对类似物A´不敏感(抗反馈抑制的突变株)；另一些可能由于编码参与氨基酸A合成酶的操纵子的控制基因发生了突变，编码出没有活性的调节蛋白而对类似物A´不敏感，(抗反馈阻遏的突变株)。

苏氨酸 酪氨酸 脯氨酸 亮氨酸 精氨酸 腺嘌呤 尿嘌呤

4、反馈抑制 赤藓糖-4P+PEP (-) 天冬氨酸 (-) (-) (-) 赖氨酸 (-) (-) 分枝酸 (-) (-) (-) 甲硫氨酸 苏氨酸 苯丙氨酸 酪氨酸 色氨酸 大肠杆菌芳香氨基酸生物合成中3种 末端产物：酪氨酸、苯丙氨酸、 色氨酸抑制各自色氨酸生物合成中的 第一步，即催化赤藓糖-4P与PEP缩合 的同功酶 G+菌中由天冬氨酸衍生的氨基酸，苏氨酸和赖氨酸以积累方式调节单一共同酶，天冬氨酸激酶、苏氨酸和甲硫氨酸调节各自合成的头一个酶

第三节 微生物的代谢反馈调节方式 一、分枝途径中末端产物的抑制作用 分枝生物合成的调节机制

(一)、同工酶 (二)、协同反馈调节： 所有末端产物过量 可抑制A到B的反应， 单个末端产物对该酶 几乎没有活性。 (三)、累积反馈调节 每一种末端产物只能 部分抑制或阻遏A到B 的反应，只有所有末 端产物过量时可完全 抑制或阻遏该酶。

(四)、顺序反馈抑制作用 S

(五)、联合激活或抑制作用 变构激活 (精氨酸的前体) 变构抑制

二、分枝生物合成途径的末端代谢产物的阻遏作用 a 枯草杆菌和 地衣杆菌中 分枝酸形成 途径上的调 节方式

b 枯草杆菌 和绿脓杆菌 的色氨酸合 成末端途经 的调节

三、微生物代谢调节机制的多样性 1、调节机制的种类

2、末端代谢产物反馈抑制作用的多样性

四、避开微生物固有代谢调节、过量生产代谢产物 1、积累末端产物 促使微生物积累末端代谢产物比积累中间代谢产物的任务更为复杂。若途径是非分支的可方便地达到此目的；若存在导致形成两种末端产物A与B的分支途径，降低B的浓度，A便被过量合成。 如赖氨酸生产：它是由细菌通过分枝途径产生的，此分枝途经也产生甲硫氨酸、苏氨酸和异亮氨酸。一些细菌含有三种天冬氨酸激酶的同工酶。每一种酶受不同末端产物调节；每一分枝的第一个酶分别受其分枝产物的反馈抑制，故不会过量生产赖氨酸。

这种天冬氨酸激酶是通过苏氨酸加赖氨酸的协同反馈抑制作用调节的，通过遗传技术获得一缺少高丝氨酸脱氢酶的突变株，只有在培养基内添加苏氨酸，此突变株才能生长，只要保持低水平的苏氨酸补充量，使苏氨酸在胞内的浓度不至于过量，天冬氨酸激酶便可避开反馈抑制作用，使代谢中间产物向赖氨酸支路转移，合成大量的赖氨酸。

赖氨酸产生菌同大肠杆菌在代谢调节方面还有以下不同：①赖氨酸产生菌仅有一种受赖氨酸和苏氨酸协同反馈阻遏作用的天冬氨酸激酶，也不存在天冬氨酸半醛脱氢酶受赖氨酸反馈阻遏问题；②赖氨酸分枝途径的双氢吡啶羧酸合成酶和双氢吡啶羧酸还原酶不受赖氨酸抑制或阻遏；③赖氨酸产生菌缺少L-赖氨酸脱羧酶。这些特性使得这些突变株能产生50g／L以上的赖氨酸。

2、细胞通透性的改变 谷氨酸生产菌即可用此法提高产量 影响通透性的因素： ● 生物素：缺少 引起细胞膜脂质 变化，生成磷脂 欠缺的膜。 ● 添加剂：青霉素 或脂肪酸衍生物。

3、能荷的调节 能荷= {[ATP]+ [ADP]}/ {[ATP]+ [ADP] + [AMP]} 能荷不仅调节形成ATP的分解代谢酶类的活性，而且调节利用ATP的生物合成酶类的活性。异柠檬酸脱氢酶和磷酸果糖激酶受高能荷的抑制，而丙酮酸羧化酶、乙酰CoA羧化酶等在同一高能荷下被激活。 4、无机磷酸盐的代谢与功能

第四节 次级代谢产物的生物合成与调节 一、微生物次级代谢的特征 1、种类繁多，结构复杂； 2、含有少见的化学键 第四节 次级代谢产物的生物合成与调节 一、微生物次级代谢的特征 1、种类繁多，结构复杂； 2、含有少见的化学键 3、一种微生物所合成的次级代谢物往往是一组结构相似的化合物 4、一种微生物的不同菌株可以产生分子结构迥异的次级代谢物，不同 种类的微生物亦能产生同一种次级代谢物 5、次级代谢产物的合成比生长对环境因素更敏感 二、次级代谢物的生物合成 合成步骤：①基质的摄人；②通过中枢代谢途径养分转化为中间体；③小分子建筑单位(前体)的合成；④中间体的修饰；⑤前体进入次级代谢物生物合成的专有途径；⑥次级代谢的主要骨架的最后修饰，成为产物。

(一)、前体 1、前体的定义 ：是指加入到发酵培养基中的某些化合物能被微生物直接结合到产物分子中去，而自身的结构无多大变化，且具有促进产物合成的作用。 中间体：是指基质进入一途径后被转化为一种或多种不同的物质，它们均被进一步代谢，最终获得该途径的终产物。前体与中间体有时是同一物质。

2、中枢途径的中间体 ● 糖通过分解代谢途径转化为分子较小的中间体 ● 酵解或三羧酸循环的中间产物

3、芳香中间体 有许多次级代谢物的芳香部分由莽草酸途径的中间体或终产物形成的。芳香氨基酸生物合成途径负责大多数放线菌和许多植物次生代谢物的生物合成。但是大多数真菌产生的芳香代谢物是由乙酸通过聚多酮(polyketide)途径合成的。

4、经修饰的糖前体 氨基糖苷类抗生素的糖，大多数来自葡萄糖，经以下一些反应修饰为所需的糖：异构化，氨化，去羟基，重排(生成分枝糖)，氧化和还原等，其碳架以整体方式结合到抗生素中。 5、甲基的来源 甲基供体：甲硫氨酸，甲基化作用需通过甲基转移酶。 (二)、前体的作用 1、起抗生素建筑材料的作用 2、诱导抗生素合成的作用

(三)、次级代谢物生物合成原理 1、把前体引入次级代谢物生物合成的专用途径，专用途径的第一个酶决定了前体进入次级代谢物生物合成的通量，中间体的流向和途径的生产能力。途径的其它酶也可能是控制步骤，通常受C、N分解代谢物的阻遏，以及P的反馈调节。 2、前体聚合作用过程，通过前体单体聚合的次级代谢物有：四环类、大环内酯类、安莎霉素(ansamycin)类、真菌芳香化合物的聚多酮类和酞类（包括同型、杂和缩酚肽）抗生素，以及聚醚和聚异戊二烯类抗生素。

聚合作用过程活化方式： ● 肽类抗生素的前体氨基酸活化方式是由ATP参与的腺苷酰氨基酸形成。 ● 在脂肪酸和大环内酯的合成中活化乙酸单位的酶是乙酰CoA合成酶，其受体是CoA。 ● 异戊二烯单位的C-5的活化通过三分子乙酰CoA的缩合，消耗ATP下形成的。 异戊烯焦磷酸单位聚合生成甾类化合物和萜烯的反应与肽类抗生素和聚酮形成的反应相似

3、次级代谢物结构的后几步修饰 ●在四环素生物合成中聚合的九酮化物中间体通过闭环转化为6-甲基四环化物，后者经几步转换，包括：C-4的氧化，C-7的氯化(对金霉素合成来说)，C-4的氨化和随后在氨基上的甲基化及在C-6上(金色链霉菌)和C-5上(龟裂链霉菌)的羟基化。 ● 红霉素生物合成的最后几步(即红霉内酯形成后)为连接两个脱氧核糖和这些糖的0-N或C—甲基化。糖连接到多烯或非多烯大环内酯上，这可能是形成糖苷的普遍现象。

4、复合抗生素中不同部分的装配

1、酶活性的调节方式有哪些？各是如何调节的？ 作业： 1、酶活性的调节方式有哪些？各是如何调节的？ 2、概念：诱导作用、顺序诱导作用、分解代谢物阻遏反馈抑制、反馈阻遏、协同反馈调节、累积反馈调节、顺序反馈抑制、。 3、画图说明反馈调节作用的消除机制，并以肌苷酸生产为例说明其积累方法，简述分离耐末端代谢产物 调节的突变株的方法。 4、以赖氨酸为例，说明选育赖氨酸产生菌的方法。 5、生产谷氨酸时，如何提高其产量？