基因工程 按照人们的愿望（人为的），进行严密的设计（类似工程设计），通过体外DNA重组（非生命活动过程）和转基因等技术，有目的地改造生物种性，使现有的物种在较短的时间内趋于完善（区别于自然突变和常规育种），创造出更符合人们需求的新的生物类型;利用这种技术对人类疾病进行有效的诊断和治疗。

基因工程突出的优点 打破了常规育种难以突破的物种之间的界限 可以使原核生物与真核生物之间的遗传信息进行相互重组和转移 可以使动物与植物之间的遗传信息进行相互重组和转移 可以使人与其他生物间的遗传信息进行相互重组和转移

基因工程的主要理论依据 不同基因具有相同的遗传物质(DNA/RNA) 基因是可以从DNA上切割下来的 基因是可以转移的 多肽与基因之间存在对应关系 遗传密码是通用的(绝少数除外) 可以通过DNA复制把遗传信息传递给下一代

基因工程的基本技术路线

重组DNA技术中常用的工具酶 工 具 酶 功 能 限制性核酸内切酶 识别特异序列，切割DNA DNA连接酶 功 能 限制性核酸内切酶 识别特异序列，切割DNA DNA连接酶 催化DNA中相邻的5´磷酸基和3´羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接 DNA聚合酶Ⅰ 合成双链cDNA分子或片段连接 缺口平移制作高比活探针 DNA序列分析 填补3´末端 Klenow片段 又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性，而无53外切活性。常用于cDNA第二链合成，双链DNA 3末端标记等 反转录酶 合成cDNA 替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析 多聚核苷酸激酶 催化多聚核苷酸5´羟基末端磷酸化，或标记探针 末端转移酶 在3´羟基末端进行同质多聚物加尾 碱性磷酸酶 切除末端磷酸基

核酸酶分类 核酸内切酶：催化水解多核苷酸内部的磷酸二酯键 核酸外切酶：从DNA或RNA链的一端逐个水解下 单核苷酸

Ⅱ型核酸限制性内切酶的基本特性 与I型及III型核酸内切限制酶不同，II型核酸内切酶只有一种多肽，并通常以同源二聚体形式存在。 它具有三个基本特性： a.  在DNA分子双链的特异性识别序列部位，切割DNA分子产生链的断裂； b.  2个单链断裂部位在DNA分子上的分布，通常不是彼此直接相对的； c.  因此，断裂的结果形成的DNA片段，也往往具有互补的单链延伸末端。

识别位点 绝大多数的II型核酸内切限制酶，都能够识别由4～8个核苷酸组成的特定的核苷酸序列。我们称这样的序列为核酸内切限制酶的识别序列。而限制酶就是从其识别序列内切割DNA分子的，因此识别序列又称为核酸内切限制酶的切割位点或靶序列。 1）有些识别序列是连续的(如GATC)， 2）有些识别序列则是间断的(如GANTC)，N是代表任意一种核苷酸碱基。

核酸内切酶 Restriction endonuclease 识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并在合适的反应条件下使每条链一定位点上的磷酸二酯键断开，产生具有3-OH和5-P基团的DNA片段的内切脱氧核糖核酸酶。 识别序列规律：旋转对称或左右互补对称。 Bam HⅠ GGATCC CCTAGG

限制性内切酶的命名 Hin dⅢ 第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； Haemophilus influenzae d株 流感嗜血杆菌d株的第三种酶 属 系 株 序 第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。

限制性内切酶识别序列的特征 1）每一种酶都有各自的特异识别序列 2）识别序列具左右互补对称(Pst I: GAATTC) 3）同位酶对切割的序列甲基化有不同的 限制性反映 4）同位酶、同裂酶、同尾酶

酶切特点 同位酶：识别相同序列切点不同。 同裂酶：识别位点相同，酶的来源不同。限制酶HpaⅡ和MspI是一对同裂酶，共同的靶子序列是CCGG。 同尾酶：识别位点不同，切出片段有相同末端序列。Sal I（5`-G   TCGAC-3`）和Xho I(5`-C  TCGAG-3`)的消化片段相连，但所形成的重组片段（5`-GTCGAG-3`）则不能被上述2种酶的任一种酶识别和切割。

Questions 1基因工程的主要理论依据:共6点 2核酸内切酶识别序列的规律 3限制性内切酶的命名 4同位酶、同裂酶、同尾酶 识别相同序列切点不同 识别位点相同，酶的来源不同。 识别位点不同，切出片段有相同末端序列。

粘性末端：产生的 DNA片段末端的一条链多出一至几个核苷酸。3´端比5´端长的称为3´粘性末端，5´端比3´端长的称为5´粘性末端。

影响限制性内切酶活性的因素 DNA的纯度 DNA的甲基化程度 温度 缓冲液 反应体积和甘油浓度 反应时间

DNA的纯度 核酸内切限制酶消化DNA底物的反应效率，在很大程度上是取决于所使用的DNA本身的纯度。污染在DNA制剂中的某些物质，例如蛋白质、酚、氯仿、酒精、乙二胺四乙酸(EDTA)、SDS(十二烷基硫酸钠)、以及高浓度的盐离子等，都有可能抑制核酸内切限制酶的活性。 为了提高核酸内切酶对低纯度DNA的反应效率，一般采用如下三种方法： ①增加核酸内切限制酶的用量，平均每微克底物DNA可高达10单位甚至更多些。 ②扩大酶催化反应的体积，以使潜在的抑制因素被相应地稀释。 ③延长酶催化反应的保温时间。 在有些DNA制剂中，尤其是按微量碱法制备的，会含有少量的DNase的污染。由于DNase的活性需要有Mg2+的存在，而在DNA的贮存缓冲液中含有二价金属离子螯合剂EDTA，因此在这种制剂中的DNA仍然是稳定的。然而在加入了核酸内切限制酶缓冲液之后，DNA则会被DNase迅速地降解掉。要避免发生这种情况，唯一的办法就是使用高纯度的DNA。

DNA的甲基化程度 核酸内切限制酶是原核生物限制—修饰体系的组成部分，因此识别序列中特定核苷酸

酶切消化反应的温度 DNA消化反应的温度，是影响核酸内切限制酶活性的另一个重要因素。不同的核酸内切限制酶，具有不同的最适反应温度，而且彼此之间有相当大的变动范围。大多数核酸内切限制酶的标准反应温度都是37℃，但也有许多例外的情况，它们要求37℃以外的其它反应温度。其中有些核酸内切限制酶的最适反应温度低于标准的37℃，例如SmaI是25℃、ApaI是30℃；有些核酸内切限制酶的最适反应温度则高于标准的37℃，例如MaeI是45℃、Bcl I是50℃、MaelII是55℃；还有些核酸内切限制酶的最适反应温度可高达60℃以上，消化反应的温度低于或高于最适温度，都会影响核酸内切限制酶的活性，甚至最终导致完全失活。

DNA的分子结构 DNA分子的不同构型对核酸内切限制酶的活性也有很大的影响。某些核酸内切限制酶切割超螺旋的质粒DNA或病毒DNA所需要的酶量，要比消化线性DNA的高出许多倍，最高的可达20倍。

核酸内切限制酶的缓冲液 核酸内切酶的标准缓冲液的组份包括：氯化镁、氯化纳或氯化钾、Tris-HCl,ß-巯基乙醇或二硫苏糖醇(DTT)以及牛血清白蛋白（BSA）等。酶活性的正常发挥，是绝对地需要二价的阳离子，通常是Mg2+。不正确的NaCl或Mg2+浓度，不仅会降低限制酶的活性，而且还可能导致识别序列特异性的改变。 缓冲液Tris—HCl的作用在于使反应混合物的pH恒定在酶活性所要求的最佳数值的范围之内。对绝大多数限制酶来说，在pH=7．4的条件下，其功能最佳。 巯基试剂对于保持某些核酸内切限制酶的稳定性是有用的，而且还可保护其免于失活。但它同样也可能有利于潜在污染杂质的稳定性。

核酸内切限制酶的缓冲液 有一部分核酸内切限制酶对于钠离子或钾离子浓度变化反应十分敏感，而另一部分核酸内切限制酶则可适应较广的离子强度的变化幅度。   在“非最适的”反应条件下(包括高浓度的核酸内切限制酶、高浓度的甘油、低离子强度、用Mn2+取代Mg2+以及高pH值等等)，有些核酸内切限制酶识别序列的特异性便会发生“松动”，从其“正确”识别序列以外的其它位点切割DNA分子。 有些核酸内切限制酶的切割特异性，受所用的缓冲液成份的影响比较明显。例如，最常用的EcoRI限制酶，在正常的情况下，是在G   AATTC识别序列处发生切割作用的，但如果缓冲液中的甘油浓度超过5％(V／V)，那么其识别序列的特异性就会发生松动，可在AATT或PuPuATPyPy序列处发生切割作用。EcoRI限制酶的这种特殊的识别能力，通常叫做星号活性，以EcoRI*表示。

限制性内切核酸酶的切割方法: 单酶切法 双酶切法 完全酶切法 部分酶切方法

DNA 连接酶 ligase DNA连接酶的发现 从细菌DNA环化现象推测存在一种能把两条DNA双链连接到一起的酶。

DNA ligase的特点 （1）大肠杆菌连接酶：只能连接粘性末端 （2）T4噬菌体的连接酶：连接粘性末端、 平末端 3）功用：DNA重组中促使载体与DNA连接

DNA聚合酶 以自身ＤＮＡ为模板，以脱氧核苷酸为底物催化合成新的ＤＮＡ的酶称为ＤＮＡ聚合酶。原核细胞和真核细胞所含的ＤＮＡ聚合酶不只是一种。大肠杆菌中存在三种，分别称为ＤＮＡ聚合酶Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ；真核细胞中也分离出五种；目前常用于基因工程的为大肠杆菌ＤＮＡ聚合酶Ｉ和ＴＤＮＡ聚合酶Ｔ噬菌体感染大肠杆菌所得，而用于PCR扩增技术的多为耐热的TaqＤＮＡ聚合酶来自一种水生嗜热杆菌。