微生物在药学中的应用

微生物与制药 抗生素 氨基酸 维生素—以辅酶或辅基形式参与生物体各种生化代谢反应，用于防治维生素缺乏引起的各种疾病。 1 食品—添加剂，调味剂L-天冬氨酰苯丙氨酸甲酸（甜味二肽）。 2 饲料—添加Lys、Met可提高饲料营养价值，鸡多产蛋，猪生长快。 维生素—以辅酶或辅基形式参与生物体各种生化代谢反应，用于防治维生素缺乏引起的各种疾病。 甾体化合物—抗炎，抗毒，抗过敏，抗休克等。治疗过敏性皮炎，类风湿关节炎，计划生育药物。 酶与酶抑制剂 α-淀粉酶 ，糖化酶，葡萄糖异构酶等； 青霉素酰化酶，门冬酰氨酶（治白血病）； 链激酶/尿激酶（去血栓）。 菌体制剂与活菌制剂 1 药用酵母—酵母（酿酒酵母） → 干燥 →  酵母粉 2 活菌制剂（合成vitamin，维持肠道内微生态平衡） （1）乳酸菌制剂（2）双歧杆菌

主要内容 第一节 抗生素的概念和分类 第二节 抗生素的分离和筛选 第三节 抗生素的制备(自学) 第四节 抗生素的生物合成机制(自学) 第五节 抗生素的作用机制 第六节 抗生素的抗药性 第七节 抗生素含量的测定 第十九章 药物抗菌实验 第二十章 药品的微生物学质量控制

第一节 抗生素的概念和分类 抗生素(Antibiotic)：是由某些生物合成或半合成的一类次 第一节 抗生素的概念和分类 抗生素(Antibiotic)：是由某些生物合成或半合成的一类次 级代谢产物或衍生物，它们在低浓度时选择性抑制或影响 它种生物的生命活动，如杀死微生物或抑制其生长。 1929年，Fleming首先从青霉菌中发现青霉素； 1940年，Florey和Chain采用溶媒萃取法获得青霉素。 1944年，Waksman在链霉菌中发现链霉素； 自本世纪40年代以来，已找到上万种新抗生素，合成了近10 万种半合成抗生素，但其中在临床上常用的仅100余种，连 同其衍生物约300余种。

Antibiotic action of soil microorganisms on a crowded plate Antibiotic action of soil microorganisms on a crowded plate. The smaller colonies surrounded by inhibition zones are streptomycetes.

抗生素的分类 （1）按化学结构 ß-内酰胺类—青霉素、头孢菌素等。 四环类—四环素、土霉素、金霉素。 氨基糖苷类—链霉素、卡那霉素、庆大霉素。 大环内酯类—红霉素、螺旋霉素、麦迪霉素。 多肽类—多黏菌素、杆菌肽等。 多烯类—制霉菌素、两性霉素B、万古霉素 苯羟基胺类—氯霉素 蒽环类—柔红霉素、阿霉素 环桥类—利福霉素

（2）按作用对象 抗G+—Pen等 抗G-—链霉素等 广谱—四环素、红霉素、卡那霉素、头孢菌素等。 抗真菌—两性霉素B、制霉菌素、灰黄霉素等。 抗肿瘤—阿霉素、丝裂霉素、柔红霉素等。

由于不同微生物之间的细胞化学结构和代谢的差异，不同的 Go！ 由于不同微生物之间的细胞化学结构和代谢的差异，不同的 抗生素的抗菌谱各异。

第二节 抗生素的分离和筛选 以从土壤中分离放线菌为例 从土壤中分离放线菌（初筛） 采土：较干燥、偏碱性、有机质丰富的土壤 Go！ 第二节 抗生素的分离和筛选 以从土壤中分离放线菌为例 从土壤中分离放线菌（初筛） 采土：较干燥、偏碱性、有机质丰富的土壤 （取5-10厘米深处）。 分离放线菌：土壤样品用无菌水稀释，获得 菌悬液，梯度稀释，选取不同稀释度接种适 宜培养基，获得单菌落纯培养。 筛选：斜面 → 摇瓶 →琼脂扩散法、滤纸片抗菌试验（G-，G+）。

抗生素传统分离方法 涂布于平板培养基28 ℃培养1周 挑取单菌落 土壤标本 培养观察抑菌圈 纯化 精制 临床研究 无菌水稀释 扩培 滤纸片 法筛选 培养观察抑菌圈 纯化 精制 临床研究

抗生素生产的工艺过程 菌种 孢子制备 种子制备 发酵 发酵液预处理 提取及精制 成品检验 成品包装

1、 菌种－ 保藏的品种经复壮后备用 2 、孢子制备－ 固体培养基培养孢子 3 、种子制备－获得菌丝供发酵之用。 4 、发酵

（1）接种量10% 左右，周期4-5天； （2）培养基—糖类，淀粉，花生饼粉，黄豆饼粉，玉米浆，蛋白胨； （3）补料工艺—延长抗生素分泌期，增加产量； （4）前体—如Pen发酵的前体为苯乙酸或苯乙胺等； （5）pH（6）温度：夹套或蛇管冷却水散热（渗漏时易导致染菌，喷淋冷却也一样） （7）通气搅 拌机械搅拌 ；挡板防涡流 （8）消泡沫 玉米油、豆油、泡敌—聚氧乙烯氧丙烯甘油0.01-0.02% （9）消毒灭菌，防止杂菌污染 菌种、空气、培养基、管道设备、防噬菌体。 （10）放罐时间 菌丝浓度、形态、残糖、氨基氮、pO2 、pH、效价。

5 、发酵液的预处理 4 、发酵 （1）发酵液中含Ca 2+ 、 Mg 2+ 、 Fe 3+ 、Protein等杂质； （5）ZnSO4与黄血盐形成复盐吸附蛋白质 （6）过滤

5 、发酵液的预处理 6 、抗生素提取和精制 7 、成品检定和包装 （3）吸附法（活性炭、大孔吸附脂）—头孢菌素 （1）溶媒萃取法—Pen （2）离子交换法—氨基糖苷类抗生素 （3）吸附法（活性炭、大孔吸附脂）—头孢菌素 （4）沉淀法——四环素 7 、成品检定和包装

第五节 抗生素的作用机制 抑制细菌细胞壁合成、 破坏细胞质膜、 作用于呼吸链以干扰氧化磷酸化、 抑制蛋白质和核酸合成等 第五节 抗生素的作用机制 抑制细菌细胞壁合成、 破坏细胞质膜、 作用于呼吸链以干扰氧化磷酸化、 抑制蛋白质和核酸合成等 抑制微生物的生长或杀死它们

主要抗生素的作用模型

Go！ 青霉素β-内酰胺环结构与D-丙氨酸末端结构相似，从而能占据D-丙氨酸的位置与转肽酶结合，并将酶灭活，肽链之间无法彼此连接，抑制了细胞壁的合成。

第六节抗药性 （drug resistance）p316

抗药性—在微生物或肿瘤细胞多次与药物接触发生敏感性降低的现象，是微生物对药物所具有的相对抗性。 获得抗药性:对原来敏感的抗生素通过遗传性的改变而获得了抗药性 多重抗药性：同时对两种以上作用机制不同的药物产生的抗药性 交叉抗药性：对结构类似或作用机制类似的抗生素均有抗药性 赖药性：不仅对该药物具有抗性，而且需要该药物作为特殊的营养因素 耐受性：该菌在最低抑菌浓度时仍受到抑制，但最低杀菌浓度提高

抗菌药物的发展史也就是细菌对其耐药性的发展史 （1）抗菌药物只要使用了足够时间，就会出现细菌耐药性，如使用青霉素25年后出现耐青霉素肺炎球菌、氟喹诺酮使用10年后出现了肠杆菌耐药； （2）耐药性是不断进化的，随着抗菌药物的应用，耐药也从低度耐药向中度、高度耐药转化； （3）对一种抗菌药物耐药的微生物可能对其他抗菌药物也耐药； （4）细菌耐药性的消亡很慢； （5）使用抗菌药物治疗后，患者容易携带耐药菌。

（2）药物选择的结果是杀死敏感菌，耐药菌富集。 2 、 细胞间抗药性的基因转移 一、抗药性产生的遗传机制 1 、自发突变与药物选择 （1）由敏感菌的遗传物质自发突变产生。 （2）药物选择的结果是杀死敏感菌，耐药菌富集。 2 、 细胞间抗药性的基因转移 染色体上的耐药基因—通过接合、转化、转导和转座子而转移。 质粒上的耐药基因—自行复制，代代相传，并在不同种属间转移（性菌毛的接合作用）

二、抗药性产生的生化机制 1、 细胞质膜透性改变 2、 药物作用靶标改变 3、 合成了修饰抗生素的酶

耐药性的控制 避免耐药菌传播（医院） 合理用药 （1）抗生素可不用尽量不用，使用时应足量。 （2）合理联合用药 抗耐药菌新抗的寻找，如酶抑制剂抗生素等。 耐药机制的研究—耐药规律寻找，有助于合理用药。

第七节 抗生素的含量测定 一、抗生素的效价单位 效价（potency）——在同一条件下比较抗生素检品和标准品的抗菌活性，从而得出检品的效价。 单位（unit,u）是衡量抗生素有效成分的具体尺度。

抗生素效价 检品的抗菌活性 效价 = 100% 标准品的抗菌活性 检品的实际单位数 100% = 检品的标示量

重量单位   以抗生素活性部分的重量为单位，1mg=1000 U 类似重量单位 以抗生素盐类纯品重量，1mg=1000 U，包括非活性部分的重量 重量折算单位 （原始活性单位相当的纯品重量为1U ）   青霉G钠盐：1mg=1667u（以50ml肉汤中抑制金葡菌生长的最小青霉素量为1 U，相当于青霉G钠盐0.5899g） 特定单位 Ex: 一批特定杆菌肽1mg ≌ 55U 标准品—与商品同质的、纯度较高的抗生素，每毫克含有一定量的单位，中国药品生物制品检定所分发 标准量—抗生素制剂标签上的标量（单位或重量）　

抗生素的效价测定 我国2010版药典规定：抗生素效价的测定采用微生物学的 方法。最常用的是琼脂扩散法中的管碟法。 （一）管碟法的设计原理 抗生素在一定的浓度范围内，其浓度的对数和抑菌圈的直 径成正比。Y=a+bX Y：抑菌圈直径，X：抗生素浓度的对数 在含有高度敏感性实验菌的琼脂平板上放置小钢管（牛津 杯），管内放入标准品和检品的溶液，经过培养，当抗生素 扩散至有效范围内就产生透明的无菌生长范围，常呈圆形， 为抑菌圈。不同浓度的抗生素其抑菌圈的直径大小不同，比 较标准品与检品的抑菌圈的大小就可计算出抗生素的效价。

二剂量法 实验菌 培养基（双层平板） 抗生素浓度范围（2：1或4：1） 培养条件（温度，时间） 举例 药物—硫酸奈替米星，572 U /mg 高剂量：低剂量 = 2：1（20 U /ml-10 U /ml） 实验菌—短小芽孢杆菌CMCC（B）63202

W=(SH+UH)-(SL+UL) V=(UH+UL)-(SH+SL) 供试品与标准品效价比θ=D*antilg(IV/W) D一般为1，I一般为lg2

第十九章—药物的抗菌实验 （抗生素的药效学） 1、抗生素的体外抗菌实验 MIC——最低抑菌浓度 MBC——最低杀菌浓度 KCS——杀菌曲线　

常用的方法 1 连续稀释法（serial dilution test） 液体稀释法（试管法） 琼脂平板倍比稀释法 2 琼脂扩散法（agar difussion test） （1）实验药物 （2）阳性对照药物 （3）阴性对照 滤纸片法 打洞法（挖孔法） 管碟法 挖沟法

1 1 液体稀释法图解

第七节 药物制剂的微生物检查 一、微生物与药物变质 空气 含细菌、霉菌、酵母等。 除菌—过滤、化学消毒、UV照射。 水—大肠杆菌通常作为水是否被粪便污染的检验指标 人体 皮肤 与外界相通的腔道 正常菌群/条件致病菌（E.coli，绿脓，沙雷氏菌） 原材料 动物脏器 中药材—晾晒、烘烤 包装物 制药设备、厂房建筑、死角管道 人流、物流　

二、无菌制剂的无菌检查 无菌检查的基本原则 三种培养基（需氧培养基、厌氧培养基和真菌 培养基），按药典的规定程序进行。 1、一般药品的无菌检查—直接接种法 需氧菌、厌氧菌、霉菌的检查 需氧菌：30-35℃，7天 厌氧菌：30-35 ℃ ，7天 霉 菌：20-25℃，7天 观察培养液是否混浊或涂片染色镜检 阳性对照—（24 h有菌生长） 金葡CMCC（B）26003 生孢梭菌CMCC（B）64941 白色念珠菌CMCC（F）98001

2、口服药及外用药的无菌检查法 一、细菌总数的测定 二、霉菌和酵母菌总数的测定 三、控制菌的检查 口服药—不能检出大肠杆菌 脏器来源口服制剂—不能检出沙门氏菌、大肠杆菌。 外用药、眼科制剂—不能检出金葡菌、绿脓杆菌。 控制菌指的是大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌及破伤风梭菌。 四、活螨的检查

Plate Count in theory, each isolated cell forms a single colony colony counts are taken on plates with 30 to 300 colonies

Another Viable Count Method - Membrane filtration

Colonies on Membrane Filters

* 举 例－大肠杆菌的检查 E.coli增菌液—胆盐乳糖培养基 分解乳糖，紫黑色金属光泽菌落 形态结构—G- ，短杆菌 菌落特征 * 举 例－大肠杆菌的检查 E.coli增菌液—胆盐乳糖培养基 分解乳糖，紫黑色金属光泽菌落 形态结构—G- ，短杆菌 菌落特征 IMVIC：+ + - -

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