实验三 叶绿素a和 同化系数Q的测定

一、目的要求  ●测定水体中叶绿素a含量和同化系数Q ●掌握初级生产力测定方法和估算

二、方法原理 地球上一切生命都需要能量，这种能量主要来自太阳。海洋生物所需要的能量，主要依赖于海洋中浮游植物体内的叶绿素，通过光合作用将太阳能转换为化学能。 海洋浮游植物是能量的原始转换者，在海洋食物链中是初始生产者，所生产的有机物和贮存的能量是海洋食物链的基础。 海洋初级生产力测定对海洋有机生产能力及渔业资源开发利用潜力的估算有着十分重要的意义。

海洋初级生产力测定方法有 叶绿素法 14C示踪法 叶绿素法 分光法 荧光法

1. 分光法测定叶绿素的原理 用丙酮萃取浮游植物中的叶绿素，然后用分光光度计测萃取液在不同波长下的吸光值，根据①～④式计算： 叶绿素a = 11.85E664－1.54 E647－0.08 E630 ① 叶绿素b = 21.03 E647－5.43 E664－2.66 E630② 叶绿素c = 24.52 E630－1.67 E664－7.60 E647 ③ 式中E为经750nm波长校正后的吸光值，即E值应扣除E750的数值，光程用1cm比色皿。

由于叶绿素a是浮游植物任一种群都具有的特征，而b或c不是任一种群都有，因此，通常用叶绿素a (Chl-a)表示初级生产力水平，其计算式为④式。 Ca（mg/m3）= ④ C－①式的结果； V丙酮－丙酮体积； V海水－海水体积。

2. 荧光法测定叶绿素a的原理 叶绿素a丙酮萃取液受蓝光（340nm）激发产生红色荧光，用荧光计在波长670nm处测定提取液酸化前后荧光值，按⑤式计算： ⑤

因 故⑤式成为⑥式： ⑥ Rb—酸化前荧光值 Ra—酸化后荧光值 R —叶绿素a酸化因子(随仪器而异） V丙酮—丙酮提取液体积（mL） V海水—过滤海水体积（L） Fd —荧光计所用量程换算因子(mg/m3)

Fd值确定的方法： ⑴标准叶绿素a校正 ⑵分光光度计校正

⑴标准叶绿素a校正： 用纯叶绿素a配成母液，把母液稀释成一系列不同浓度的溶液并分别测定荧光读数，用直线回归法求出标定线的斜率Fd。

⑵分光光度计校正(本实验采用此法)： 取一定体积处于指数生长期的单细胞藻，丙酮萃取其叶绿素a，测其吸光值E，按①式计算提取液叶绿素a浓度Cchl-a，然后在荧光计测其荧光值Rb，依⑦式计算Fd。 ⑦

3、初级生产力pp的计算 Cadée和hegeman（1974）提出计算初级生产力简化公式： （8） 式中，P－每日现场初级生产力；Pa－表层水中浮游植物潜在生产力；E－真光层深度；D－每日光照时间。

3、初级生产力pp的计算 因为表层水E＝1m水深内浮游植物潜在的生产力： （8） 故可写成： (9) PP－每日生产力（mgC/m3d）； 故可写成： (9) PP－每日生产力（mgC/m3d）； Ca－表层水中叶绿素-a含量（mg/m3）； D－每日的光照时间，冬天以12h计，夏天以13h计。 Q－浮游植物光合作用速率与叶绿素-a含量之比值，单位mgC(mgChl-a)-1h-1，称为同化系数。

4. 同化系数的确定 用叶绿素a含量估算调查海区初级生产力，必须求得同化系数Q。 Q是在光饱和状态下单位时间单位含量叶绿素-a所同化的碳量。 不同类型藻类种群或同一种群在不同环境，同化系数不一样。

4. 同化系数的确定 为得到适用于调查海区的同化系数，最好用C14示踪法现场测定。 在无测定C14示踪法条件下可用黑白瓶作浮游植物光合作用速率的测定。根据浮游植物光合过程中释放的氧量换算成有机碳的固定量，以此固定值除以叶绿素a和培养时间即为同化系数Q。

设符合光合作用的理想方程是CO2+H2O→CH2O+O2 4. 同化系数的确定 设符合光合作用的理想方程是CO2+H2O→CH2O+O2 则产生的氧转换成固定碳，则有： （10） Q—同化系数[mgC(mgChl-a)-1h-1] h—光照时间(h) Chl-a—叶绿素a含量(mg/m3)； Ol、Od—“白”和“黑”瓶DO(mgO2/L)

三、实验设备 1、仪器

UV1600紫外光栅分光光度计

GFY－160荧光光度计

960MR荧光光度计

LRH-250-G型光照培养箱

离心机

过滤器 0.45μm微孔醋酸纤维滤膜

医用真空吸引器

2、玻璃器皿 250mL BOD瓶2个(黑白各1个) 碱式滴定管1根 10mL移液管 1支 碘量瓶 2个 2mL移液管 3支 碘量瓶 2个　 具塞刻度试管4支 100mL量筒1个　 　 水样桶2个 碱式滴定管1根 10mL移液管 1支 2mL移液管 3支 1mL移液管 1支

3、试剂(*为学生自配试剂） （1）90% 丙酮* （2）1% MgCO3 (3) 0.01mol/L Na2S2O3溶液 （4）0.0100 mol/L KIO3标准溶液* （5）MnCl2溶液 （6）碱性KI溶液 （7）1+1 H2SO4 （8）1＋3 H2SO4 （9）0.5％淀粉指示剂* （10）固体KI

四、实验内容 1. 换算因子Fd的确定 2. 同化指数Q的测定 3. 荧光法测水样Chl-a　　

1. 换算因子Fd的确定 过滤 滤膜 具塞试管 15mL 离心10min 定容10mL 水样A平行样 混匀 （20～30ml） 匀浆器  =45mm 0.45M P＜0.5atm 滤膜 ↓1d1% MgCO3 混匀 水样A平行样 （20～30ml） 匀浆器 具塞试管 15mL ↓90% 丙酮 研磨 离心10min ( 3000~4000r/min) 有机相 1cm比色皿 定容10mL

先→ → → → → → → 按①式和④式分别求Cchl-a和Ca 752紫外可见光 光度计 GFY－160荧光计 按⑦式求Fd1 测 E750E664 E647E630 按①式和④式分别求Cchl-a和Ca 752紫外可见光 光度计 先→ → → → → → → 测Rb1 激发波长346nm 发射波长670nm 负高压500mV 狭缝0.1 GFY－160荧光计 按⑦式求Fd1 960MC荧光计 按⑦式求Fd2 测Rb2

2、同化指数Q的测定 置于光照培养箱培养2～4h BOD白瓶 BOD黑瓶 （250mL） 装满水样A 按（10）式 计算Q 固定 碘量法测白瓶和黑瓶 DO（Ol和Od）

3、水样叶绿素a的测定 按实验步骤1 分别用GFY-160荧光法和960MC荧光计测Rb 过滤 水样B平行样 按⑥式计算Chl-a 20～30mL

4.初级生产力估算 根据表2的数据和实验步骤3的结果，按⑨式计算该样水域的初级生产力水平PP。

五、数据处理和问题讨论 求Fd值和Q值。 计算水样Chl-a和初级生产力PP （两种仪器） 测溶解氧时要注意哪些事项？ 本实验有哪些主要误差来源？ 计算水样A、B平行样Chl-a含量的相对偏差 计算实验B用两种不同荧光计测定Rb求出的Chl-a的相对偏差 注意：实验报告要把计算过程写出来。

六、注意事项 采样地点：芙蓉湖，A样和Ｂ样在芙蓉湖内的不同站位采集。 水样A和B均应做平行样。