生化技术

绪论 1定义 生化技术——在生物化学及其相关学科应用的各种技术，主要指生物体内物质及其代谢产物，特别是生物大分子的分离、检测、制备与改造技术。

2发展过程 1923 Svedberg设计超速离心机 1925 Warberg发明微量检压仪 1930 放射性同位素技术在生物化学过程中应用 1930 放射性同位素技术在生物化学过程中应用 1931 Kuhn柱层析分离α、β-胡萝卜素 1940 电泳、层析技术 50-52 气相色谱（GC） 1956 Sanger x射线衍射技术确定蛋白质一级结构 1953 Watson、Crick x射线衍射技术 DNA双螺旋结构 1960 操纵子学说 1964 人工合成胰岛素 1969 固定化酶、细胞技术 1973 基因工程 1975 细胞工程（杂交瘤技术） 1990 启动人类基因组计划 1996 “多莉”羊诞生 

第一篇      生化分离技术 第一章      生物大分子的提取与沉淀分离技术 生物大分子：蛋白质、酶、核酸、多糖和脂类

第一节 细胞破碎 细胞破碎的原因： 破碎的主要方法：机械法、物理法、化学法、酶法

1 机械破碎方法 1. 1高速组织捣碎机 原理 操作：装料，低速→高速 效果：作用强烈，活性物质易受破坏 1. 2匀浆器 原理： 1.   1高速组织捣碎机 原理 操作：装料，低速→高速 效果：作用强烈，活性物质易受破坏 1.   2匀浆器 原理： 效果：破碎程度较捣碎机高，破坏较少 1.   3研磨器

2 物理破碎 2.1温度差破碎法 2.2压力差破碎法 2.3超声波破碎法 影响因素：样品浓度、超声波频率、功率、破碎时间 操作：冰浴、间歇进行 适用于悬浮细胞破碎

3化学破碎法 原理：化学试剂改变或破坏细胞膜结构 常用试剂：有机溶剂、表面活性剂 4 酶学破碎法 外加酶制剂或自溶法

第二节 提取 1 提取的基本概念与影响因素 提取（抽提或萃取）： 主要影响因素： a 欲提取的物质在所用的溶剂中的溶解度；b该物质向溶剂扩散的难易 溶解度大小：a 溶剂：相似相溶；b 温度 c等电点 2 蛋白质和酶的提取 提取方法：水溶液提取、有机溶剂提取、混合提取 选择方法依据：存在部位、分子结构和溶解性质

2.1水溶液提取 水、稀盐、稀酸、稀碱溶液 常用稀盐溶液和缓冲液，应注意控制盐浓度、温度、pH 2.1.1盐浓度的选择 一般用等渗盐溶液。但根据溶解度，有些蛋白质要用较高浓度盐溶液提取，而有些则用纯水提取。

2.1.2 pH的选择 不在等电点附近，但不宜太高或太低。 pH3~4有利于离子键分离 2.1.3温度的选择 一般0~10℃（常用4℃），对于耐高温的蛋白质和酶，可适当提高温度，可使杂蛋白变性分离，有利于提取和进一步纯化。 2.1.4添加底物或辅酶有利于酶的提取

2.2有机溶剂提取 常用有机溶剂：乙醇、丙酮、丁醇等 注意：蛋白质提取应根据不同蛋白质的不同性质选用不同的提取条件

3 核酸的提取 类化合物都溶于水而不溶于有机溶液，一般用水溶液提取。提取的一般都是核蛋白。 DNA-Pro.与RNA-Pro.在不同浓度电解质溶液中溶解度有明显差别： 0.14mol/L NaCl: RNA-Pro.溶解度相当大，DNA-Pro.溶解度仅为水中1％。 1 mol/L NaCl: RNA-Pro.溶解度小，DNA-Pro.溶解度比水中大2倍。 DNA-Pro.与RNA-Pro.在不同pH下溶解度不同 RNA-Pro. PH2.0-2.5 S最小 DNA-Pro. PH4.2 S最小 应选择不同的条件提取分离DNA-Pro.与RNA-Pro.

3.1 RNA提取 细胞破碎 →水溶 →过滤去渣 →调pH5 → tRNA↓ mRNA，rRNA: 3.1.1 稀盐溶液提取 细胞破碎 → 匀浆0.14 mol/L NaCl→RNA-Pro提取液→分离DNA-Pro、Pro、多糖 RNA：tRNA15%，mRNA5%，rRNA80%

3.1.2 苯酚水溶液提取 细胞破碎 → 匀浆等体积90％苯酚水溶液振荡→RNA、Pro分开→RNA、多糖（水层）； DNA、Pro（苯酚层） 冷酚法、热酚法，注意苯酚除杂 3.2 DNA提取 浓盐法：1mol/L氯化钠溶液提取，＋含少量辛醇或戊醇的氯仿一起振荡除去蛋白质 或：先用稀盐除去RNA－Pro，再用浓盐提取 也可用苯酚法，苯酚层得到 DNA、Pro

第三节 沉淀分离 分离纯化：除去各种杂质，获得较高纯度物质的过程 蛋白质和酶分离提纯方法：沉淀分离、层析分离、电泳分离、超离心分离等。 沉淀分离：通过改变某些条件或加入某种物质，使溶液中某种溶质的溶解度降低，从而从溶液中沉淀析出的技术。包括盐析沉淀、等电点沉淀、有机溶剂沉淀、复合沉淀法、金属盐沉淀法、选择性变性沉淀等。

3.1 盐析沉淀法 蛋白质在水溶液中的溶解度受盐浓度影响 盐溶： 盐析：    盐浓度改变蛋白质溶解度：改变蛋白质分子表面电荷，同时改变溶液中水的活度，改变水膜

蛋白质溶解度与溶液中离子强度关系： lg(S/S0)= -ksI lgS=lgS0-ksI=β-ksI β为常数，取决于蛋白性质、T、pH ks为盐析常数，与盐性质（离子价数、离子半径等）、蛋白结构有关 ks越大，盐析效果越好 I=(1/2)∑mizi2 一定条件下，S取决于I 分段盐析：ks分段盐析（β一定，pH、T一定）；β分段盐析（ks、I一定，改变pH、T）

3.1.2盐的选择 通常采用中性盐，最常用（NH4）2SO4，原因： 水中S大，温度对S影响小，廉价易得，不易引起蛋白质变性，分段效果好。

3.1.3盐析注意事项 （1） 盐纯度高，沉淀完全后再分离； （2） 分段盐析分离几种蛋白质，与等电点沉淀配合； （3） 室温或低温进行； （1）      盐纯度高，沉淀完全后再分离； （2）      分段盐析分离几种蛋白质，与等电点沉淀配合； （3）      室温或低温进行； （4）      选择合适浓度的样品； （5）      脱盐（透析、电渗析、凝胶层析、超滤）

3.2 等电点沉淀法 3. 3有机溶剂沉淀法 常用丙酮、异丙酮、乙醇、甲醇等 适用范围： 缺点：易变性 操作：低温，沉淀分离后快稀释，添加少量无机盐，pH接近pI，用量试验确定，可先浓缩。 3.4 选择性变性沉淀 杂蛋白变性沉淀，不影响所需蛋白

三 核酸的沉淀分离 温度：0～4℃ ，防止变性和降解 加入核酸酶抑制剂防止核酸酶引起的水解 1 有机溶液沉淀法 乙醇 2 等电点沉淀法 3 钙盐沉淀法（氯化钙＋乙醇） 4 选择性溶剂沉淀法

思考题 1 名词解释 提取；分离；盐溶；盐析 2 为何要进行细胞破碎？有哪些破碎方法？ 3 影响物质提取的主要因素有哪些？ 4 蛋白质和酶主要提取方法？沉淀分离方法？ 5 核酸主要提取方法？沉淀分离方法？