Amino acids, Peptides and Proteins 蛋白質體學 Proteomics 2012 Amino acids, Peptides and Proteins 陳威戎 2012. 09. 17~ 10. 01 純化酵素是一件非常基本的工作，很多重要的研究，都脫不開酵素的純化工作。而大多數酵素的純化，基本上也脫不開一些最基本的原則。 首先，建立一個完善的酵素實驗室是很必要的；我們把許多實驗室內的運作細節一一交代，期望同學能認知這些經驗，確實接收並養成習慣，且期望應用到將來每個人的研究工作上。 最先遇到，但是最容易被忽視的步驟，就是材料處理及總蛋白質的抽取。將提醒你小心選擇採料的種類、時期、部位等，並選擇一個良好的粗抽取方式，以便有一個良好的開始。

Covalent Structure of Proteins Outline Amino Acids Peptides and Proteins Covalent Structure of Proteins 純化酵素是一件非常基本的工作，很多重要的研究，都脫不開酵素的純化工作。而大多數酵素的純化，基本上也脫不開一些最基本的原則。 首先，建立一個完善的酵素實驗室是很必要的；我們把許多實驗室內的運作細節一一交代，期望同學能認知這些經驗，確實接收並養成習慣，且期望應用到將來每個人的研究工作上。 最先遇到，但是最容易被忽視的步驟，就是材料處理及總蛋白質的抽取。將提醒你小心選擇採料的種類、時期、部位等，並選擇一個良好的粗抽取方式，以便有一個良好的開始。

Amino Acids Proteins are polymers of amino acids, with each amino acid residues joined to its neighbor by a specific covalent bond. Twenty different amino acids are commonly found in proteins. First: asparagine (1806) ; last: threonine (1938). Names derived from the sources: Asparagine – asparagus Glutamate – wheat gluten Tyrosine – cheese Glycine – sweet taste 純化酵素是一件非常基本的工作，很多重要的研究，都脫不開酵素的純化工作。而大多數酵素的純化，基本上也脫不開一些最基本的原則。 首先，建立一個完善的酵素實驗室是很必要的；我們把許多實驗室內的運作細節一一交代，期望同學能認知這些經驗，確實接收並養成習慣，且期望應用到將來每個人的研究工作上。 最先遇到，但是最容易被忽視的步驟，就是材料處理及總蛋白質的抽取。將提醒你小心選擇採料的種類、時期、部位等，並選擇一個良好的粗抽取方式，以便有一個良好的開始。

Amino acids share common structural features 純化酵素是一件非常基本的工作，很多重要的研究，都脫不開酵素的純化工作。而大多數酵素的純化，基本上也脫不開一些最基本的原則。 首先，建立一個完善的酵素實驗室是很必要的；我們把許多實驗室內的運作細節一一交代，期望同學能認知這些經驗，確實接收並養成習慣，且期望應用到將來每個人的研究工作上。 最先遇到，但是最容易被忽視的步驟，就是材料處理及總蛋白質的抽取。將提醒你小心選擇採料的種類、時期、部位等，並選擇一個良好的粗抽取方式，以便有一個良好的開始。

Two conventions used to identify the carbons in an amino acid The α-carbon atom is a chiral center. 純化酵素是一件非常基本的工作，很多重要的研究，都脫不開酵素的純化工作。而大多數酵素的純化，基本上也脫不開一些最基本的原則。 首先，建立一個完善的酵素實驗室是很必要的；我們把許多實驗室內的運作細節一一交代，期望同學能認知這些經驗，確實接收並養成習慣，且期望應用到將來每個人的研究工作上。 最先遇到，但是最容易被忽視的步驟，就是材料處理及總蛋白質的抽取。將提醒你小心選擇採料的種類、時期、部位等，並選擇一個良好的粗抽取方式，以便有一個良好的開始。

L-Form Amino Acid Structure Carboxylic group COO - Amino group a H N 3 + H H = Glycine 當你 忘記胺基酸的構造時，胸前畫個十字禱告奇蹟馬上出現。 你只要在這十字的中央，先填上一個碳原子 (叫做 a 碳)，在周圍的四個位置分別填上一個 胺基、酸基 (因為是寫胺基酸構造)、氫原子 及一個 R 基團，基本的胺基酸構造即完成。 R 基團可以由最簡單的 H 開始填入，就是最簡單的 glycine；再來 CH3 就是 alanine；如此越來越大，並加入其它種類的原子 (如氧或硫)，或額外的胺基、酸基或醇基，就可以組成多采多姿的二十種胺基酸。 R group CH3 = Alanine Juang RH (2007) BCbasics

Amino Acid Subway Map Aromatic Trp W Arg R Basic Y Tyr Lys K Asn N Gln Northwest line Chung-San line Amino Acid Subway Map -C-C-C-N-C-N N+ = Aromatic Trp W -C- N Arg R Nan-Kan line Basic -C- -OH -C-CONH2 -C-C-CONH2 Y Tyr Lys K Asn N Gln Q Amide -C-C-C-C-NH3+ -C- His H Phe F Asp D Glu E Acidic -C-C C N N+ -C-COOH -C-C-COOH Aliphatic Gly G A Ala V Val I Ile Leu L Central line -H -CH3 C C -C C -C-C-C C -C-C-C Ser S Cys C -C-OH -C-SH C C C HN C-COOH a Circular line 把 二十種胺基酸編在虛擬的台北市地下鐵系統中，依其側基的特性分布在各條線路上，主要目的是要清楚表達各種胺基酸的特性，因為以後在蛋白質中的腳色很重要。 請特別注意，這只是虛擬的構造相關圖，並非代謝路徑。 一定要把胺基酸的中英文名稱、兩種縮寫法、分子構造等，努力背起來，絕對有益於你未來的學習與發展。依照上面各路線的分類來背，比較合乎邏輯，並且容易記憶。 South line -C-C OH Thr T Met M Juang RH (2007) BCbasics Non-polar -C-C-S-C P Pro Imino, Circular Polar Hydroxy Sulfur

純化酵素是一件非常基本的工作，很多重要的研究，都脫不開酵素的純化工作。而大多數酵素的純化，基本上也脫不開一些最基本的原則。 首先，建立一個完善的酵素實驗室是很必要的；我們把許多實驗室內的運作細節一一交代，期望同學能認知這些經驗，確實接收並養成習慣，且期望應用到將來每個人的研究工作上。 最先遇到，但是最容易被忽視的步驟，就是材料處理及總蛋白質的抽取。將提醒你小心選擇採料的種類、時期、部位等，並選擇一個良好的粗抽取方式，以便有一個良好的開始。

純化酵素是一件非常基本的工作，很多重要的研究，都脫不開酵素的純化工作。而大多數酵素的純化，基本上也脫不開一些最基本的原則。 首先，建立一個完善的酵素實驗室是很必要的；我們把許多實驗室內的運作細節一一交代，期望同學能認知這些經驗，確實接收並養成習慣，且期望應用到將來每個人的研究工作上。 最先遇到，但是最容易被忽視的步驟，就是材料處理及總蛋白質的抽取。將提醒你小心選擇採料的種類、時期、部位等，並選擇一個良好的粗抽取方式，以便有一個良好的開始。

Absorption of ultraviolet light by aromatic amino acids 純化酵素是一件非常基本的工作，很多重要的研究，都脫不開酵素的純化工作。而大多數酵素的純化，基本上也脫不開一些最基本的原則。 首先，建立一個完善的酵素實驗室是很必要的；我們把許多實驗室內的運作細節一一交代，期望同學能認知這些經驗，確實接收並養成習慣，且期望應用到將來每個人的研究工作上。 最先遇到，但是最容易被忽視的步驟，就是材料處理及總蛋白質的抽取。將提醒你小心選擇採料的種類、時期、部位等，並選擇一個良好的粗抽取方式，以便有一個良好的開始。

純化酵素是一件非常基本的工作，很多重要的研究，都脫不開酵素的純化工作。而大多數酵素的純化，基本上也脫不開一些最基本的原則。 首先，建立一個完善的酵素實驗室是很必要的；我們把許多實驗室內的運作細節一一交代，期望同學能認知這些經驗，確實接收並養成習慣，且期望應用到將來每個人的研究工作上。 最先遇到，但是最容易被忽視的步驟，就是材料處理及總蛋白質的抽取。將提醒你小心選擇採料的種類、時期、部位等，並選擇一個良好的粗抽取方式，以便有一個良好的開始。

Reversible formation of the disulfide bond 純化酵素是一件非常基本的工作，很多重要的研究，都脫不開酵素的純化工作。而大多數酵素的純化，基本上也脫不開一些最基本的原則。 首先，建立一個完善的酵素實驗室是很必要的；我們把許多實驗室內的運作細節一一交代，期望同學能認知這些經驗，確實接收並養成習慣，且期望應用到將來每個人的研究工作上。 最先遇到，但是最容易被忽視的步驟，就是材料處理及總蛋白質的抽取。將提醒你小心選擇採料的種類、時期、部位等，並選擇一個良好的粗抽取方式，以便有一個良好的開始。

純化酵素是一件非常基本的工作，很多重要的研究，都脫不開酵素的純化工作。而大多數酵素的純化，基本上也脫不開一些最基本的原則。 首先，建立一個完善的酵素實驗室是很必要的；我們把許多實驗室內的運作細節一一交代，期望同學能認知這些經驗，確實接收並養成習慣，且期望應用到將來每個人的研究工作上。 最先遇到，但是最容易被忽視的步驟，就是材料處理及總蛋白質的抽取。將提醒你小心選擇採料的種類、時期、部位等，並選擇一個良好的粗抽取方式，以便有一個良好的開始。

純化酵素是一件非常基本的工作，很多重要的研究，都脫不開酵素的純化工作。而大多數酵素的純化，基本上也脫不開一些最基本的原則。 首先，建立一個完善的酵素實驗室是很必要的；我們把許多實驗室內的運作細節一一交代，期望同學能認知這些經驗，確實接收並養成習慣，且期望應用到將來每個人的研究工作上。 最先遇到，但是最容易被忽視的步驟，就是材料處理及總蛋白質的抽取。將提醒你小心選擇採料的種類、時期、部位等，並選擇一個良好的粗抽取方式，以便有一個良好的開始。

Asp Asn Ser Arg Tyr Cys His Gln Thr Glu Lys Gly Ala Ile Phe Trp Met Classification of Amino Acids by Polarity Acidic Neutral Basic Asp Asn Ser Arg POLAR Tyr Cys His Gln Thr Glu Lys Gly Ala Ile Phe NON- POLAR Trp Met Val Leu Pro 不管 二十種胺基酸的構造、名稱有沒有背起來，熟知各種胺基酸側鏈基團的性質，也是同等重要的事。 若大略分成兩類，則可分成極性及非極性兩大類，可說是最重要的基本分類；因為胺基酸基團的極性或非極性，最後會影響所形成蛋白質的整體構造與性質。 很明顯地，非極性胺基酸在大小上有相當大的差別，而且是各種大小都有，好像是一套很完整的積木，將來可有效地填塞在蛋白質的核心部份，構成堅實的蛋白質構造。另一方面，極性胺基酸又分成酸性、中性、鹼性三大類，每大類又包含二到數種，也有大小上的差異，但鹼性胺基酸的基團都相當長。 上表的分類只是參考，一些比較難以分類的胺基酸 (如 Tyr, Gly, His)，其性質就比較模糊，但也各有其存在目的，而且經常有相當重要的角色。 Polar or non-polar, it is the bases of the amino acid properties. Juang RH (2007) Biochemistry

純化酵素是一件非常基本的工作，很多重要的研究，都脫不開酵素的純化工作。而大多數酵素的純化，基本上也脫不開一些最基本的原則。 首先，建立一個完善的酵素實驗室是很必要的；我們把許多實驗室內的運作細節一一交代，期望同學能認知這些經驗，確實接收並養成習慣，且期望應用到將來每個人的研究工作上。 最先遇到，但是最容易被忽視的步驟，就是材料處理及總蛋白質的抽取。將提醒你小心選擇採料的種類、時期、部位等，並選擇一個良好的粗抽取方式，以便有一個良好的開始。

純化酵素是一件非常基本的工作，很多重要的研究，都脫不開酵素的純化工作。而大多數酵素的純化，基本上也脫不開一些最基本的原則。 首先，建立一個完善的酵素實驗室是很必要的；我們把許多實驗室內的運作細節一一交代，期望同學能認知這些經驗，確實接收並養成習慣，且期望應用到將來每個人的研究工作上。 最先遇到，但是最容易被忽視的步驟，就是材料處理及總蛋白質的抽取。將提醒你小心選擇採料的種類、時期、部位等，並選擇一個良好的粗抽取方式，以便有一個良好的開始。

Uncommon amino acids also have important functions 純化酵素是一件非常基本的工作，很多重要的研究，都脫不開酵素的純化工作。而大多數酵素的純化，基本上也脫不開一些最基本的原則。 首先，建立一個完善的酵素實驗室是很必要的；我們把許多實驗室內的運作細節一一交代，期望同學能認知這些經驗，確實接收並養成習慣，且期望應用到將來每個人的研究工作上。 最先遇到，但是最容易被忽視的步驟，就是材料處理及總蛋白質的抽取。將提醒你小心選擇採料的種類、時期、部位等，並選擇一個良好的粗抽取方式，以便有一個良好的開始。

Uncommon amino acids also have important functions 純化酵素是一件非常基本的工作，很多重要的研究，都脫不開酵素的純化工作。而大多數酵素的純化，基本上也脫不開一些最基本的原則。 首先，建立一個完善的酵素實驗室是很必要的；我們把許多實驗室內的運作細節一一交代，期望同學能認知這些經驗，確實接收並養成習慣，且期望應用到將來每個人的研究工作上。 最先遇到，但是最容易被忽視的步驟，就是材料處理及總蛋白質的抽取。將提醒你小心選擇採料的種類、時期、部位等，並選擇一個良好的粗抽取方式，以便有一個良好的開始。

Hydride, Hydrogen and Proton + 1s + - - + Proton - - - H 1.008 1 Hydrogen atom 氫原子 是唯一不含有中子的原子，因為原子核中只有一個質子，所以不須要中子介入。氫原子有一個電子，當它獲得一個額外電子，即成為氫離子 (稱 hydride, :H-)；若 hydride 丟掉一個電子，就變回氫原子；當氫原子再失去一個電子，就剩下質子 (H+)。 附在分子基團上的氫原子 (如 -COOH 上面的 H) 因其陰電性太弱，因此電子常被附近的大原子搶走，剩下的質子脫出，電子則留在原來的分子，成為帶負電基團 (-COO-)。 游離出來的質子，很容易吸附到電子較多的基團上 (例如 –NH2 上有一對多餘的電子)，而給後者帶來一個正電 (成為 –NH3+)。這些可放出或吸收質子的基團，就是緩衝液的基本材料。當環境質子太多，就容易吸收質子；當環境質子太少，就釋放質子出來。 在水環境中，質子數量的多寡就是酸鹼度的指標，會影響分子上各種基團的帶電性質。而巨分子上這些電荷性質的變化，就是生物化學裡許多反應機制的根本肇因。 雖然環境中到處充斥著質子，但以能量而言質子並無貢獻；因為質子已經失去了電子，而電子是生物界的能量根源。但具有一個額外電子的 hydride 就是具有能量位階的粒子，是自然界中能量的貯藏處。 汽油是由飽和碳氫化合物所組成 (如辛烷)，其碳原子上鍵結滿了氫原子，這些氫原子都擁有足額電子，有相當的化學能蘊藏。故當汽車燃燒汽油，氧化反應奪取這些電子，把碳原子變成二氧化碳，氫變成水分子 (氧化二氫 H2O)，同時放出能量。 Juang RH (2007) BCbasics

N N C C Proton Is Adsorbed or Desorbed H H+ H Amino H+ Carboxylic O H Proton： abundant and small, affects the charge of a molecule Low High lone pair electrons pKa H H+ N H N Amino H+ High Low pKa Carboxylic C O H C O H+ 質子 proton 是宇宙中的奇妙粒子，這是一顆光溜溜的粒子；當氫原子丟掉一個電子後，即可得到質子，因此寫作 H+。 質子可以隨時附著到一個帶有電子密度的基團 (如胺基)，使該基團多帶 了一個正電。質子也很容易由某一個基團脫出 (如羧基)，而使該基團成為帶負電。 胺基酸同時帶有上面兩種基團，因此可同時帶有正電及負電，稱為雙性離子 ampholyte。若胺基酸同時帶有一個正電及一個負電，則其淨電荷為零，特稱之為 zwitterion。 請注意上述基團的解離與否，受環境 pH 影響甚鉅；當環境的 pH 大於此基團的 pKa 時，此基團將帶負電；反之則帶正電。因此，一個基團的 pKa 越小 (我們說越酸性的物質)，就越容易帶負電，因為其質子很容易跑掉，剩下的分子就呈負電荷。 再舉一例，glycine 上有胺基及羧基各一，其 pKa 分別為 9.6 及 2.3，則在中性 pH 下，其胺基將帶正電如上圖 (因為環境 pH < 胺基的 pKa)；反之羧基則帶負電如上圖。在中性溶液中，glycine 因此同時帶有正電及負電各一，是一個 zwitterion。 Ampholyte contains both positive and negative groups on its molecule Juang RH (2007) BCbasics

Amino acids can act as acids and bases 純化酵素是一件非常基本的工作，很多重要的研究，都脫不開酵素的純化工作。而大多數酵素的純化，基本上也脫不開一些最基本的原則。 首先，建立一個完善的酵素實驗室是很必要的；我們把許多實驗室內的運作細節一一交代，期望同學能認知這些經驗，確實接收並養成習慣，且期望應用到將來每個人的研究工作上。 最先遇到，但是最容易被忽視的步驟，就是材料處理及總蛋白質的抽取。將提醒你小心選擇採料的種類、時期、部位等，並選擇一個良好的粗抽取方式，以便有一個良好的開始。

+1 -1 NH2 H+ NH2 H+ COO- R - C - H COO- NH2 R - C - H R - C - H COOH Acidic environment Neutral environment Alkaline environment pK2 ~ 9 NH2 H+ NH2 H+ COO- R - C - H COO- NH2 R - C - H R - C - H COOH pK1 ~ 2 5.5 胺基酸 非常特別，同一個分子上同時帶有一個弱酸及弱鹼；因此可以用胺基酸來作為酸性或鹼性的緩衝液。例如，某胺基酸的酸基 pK1 = 2，胺基的 pK2 = 9，則此胺基酸在 pH 為 2 或 9 附近，都有緩衝作用。 在胺基酸質子的解離過程中，在某個 pH 條件下，同時帶有一個正電及負電 (上圖中央)，其淨電荷恰好為零，這種形式稱為 zwitterion，這個 pH 則稱為此胺基酸的等電點 (pI)；處於等電點的胺基酸並非不帶電，而是正、負電荷的數目剛好相等。 等電點的算法很簡單，只要把等電點上下的兩個 pK 值平均即得；如上例中 (2 + 9) ÷ 2 = 5.5。 +1 -1 Isoelectric point Juang RH (2007) BCbasics

Amino Acids Have Buffering Effect 12 9 6 3 pH pK2 ★ H-C-R COO- NH2 H+ Isoelectric point = pI pK1 + pK2 2 ★ pK1 由 上面胺基酸的滴定曲線看來，當環境的 [OH-] 逐漸增加時，在其兩個 pK 處的 pH 變化最小，具有緩衝作用；而在其 pI 處，幾乎完全沒有緩衝作用。為何處於等電點的分子，完全不具緩衝作用？ 而其分子上有一個 H+，看來可以作為供應質子者；也有一個 –COO- 可以作為接受質子者，非常完美。 原因是這個 H+ 無法放出，因為攜帶 H+ 的基團是 –NH3+，要到 pH = 9 才會放出 (因為其 pK = 9)；相似的理由，這個 –COO- 也無法接受質子，成為 –COOH，要到 3 以下才行。因此，你可以得到一個概念，分子上的這些基團能否收放質子，都決定於其自身的 pK。回過來想一想，pK 到底是什麼？ pK 就是描述一個基團釋出或吸收質子的能力或程度，pK 越大的基團，就越不容易釋出；反之，pK 越小的基團，也就越不容易吸入質子。 [OH] → Juang RH (2007) BCbasics

+ - - Environment pH vs Protein Charge 10 9 8 7 6 5 4 3 Buffer pH Isoelectric point, pI 通常 一個蛋白質分子上都帶有電荷，有正電荷、也有副電荷，這些正、負電荷的淨值，即為此蛋白質所帶的 淨電荷；蛋白質的淨電荷可能為正、也可能為負，在某 pH 下蛋白質的淨電荷可能為零，則此 pH 稱為此蛋白質的『等電點』(isoelectric point, pI)，一個蛋白質的 pI 通常不會變，除非其胺基酸的組成改變。 當環境的 pH 大於某蛋白質的的 pI (如上圖某蛋白質的 pI = 6，環境 pH = 9)，則此蛋白質的淨電荷為負；反之則為正值。另外，環境的 pH 離其 pI 越遠，則其所帶的淨電荷數目將會越大；越接近 pI 時，所帶淨電荷變小，最後在其 pI 處淨電荷為零。因此，蛋白質溶液的 pH 要很小心選擇，以便使該蛋白質帶有我們所需要的淨電荷，或者不帶有淨電荷。 + - - Net Charge of a Protein Juang RH (2007) BCbasics

pKa of Amino Acid Residues Residues on amino acids can release or accept protons -COOH -COO- a + H+ pKa = 1.8~2.4 -COOH -COO- R + H+ pKa = 3.9~4.3 -Imidazole·H+ -Imidazole His + H+ pKa = 6.0 -SH -S- Cys + H+ pKa = 8.3 -OH -O- Tyr + H+ pKa = 10 -NH3+ -NH2 a + H+ pKa = 8.8~11 -NH3+ -NH2 R + H+ pKa = 10~12.5 Smaller pKa releases proton easier 胺基酸 上面的基團，若屬於弱酸或弱鹼，能夠可逆性地吸收或放出質子，就可以作為緩衝液之用。每個弱酸或弱鹼，都有一個解離常數，通常以 pKa 來表示；前面已經說過，一個可作為緩衝的基團，其緩衝範圍就在它的 pKa 附近。而 pKa 越小者，越容易放出質子，比較適用在酸性 pH 的緩衝液；pKa 大者則適用在鹼性的 pH。 所有胺基酸的胺基及酸基，其 pKa 都不接近中性，而 R 側基上的各種基團，只有 His 上面的 imidazole 有接近中性的 pKa (6.0)。 因此，His 在蛋白質的構造中，可以有緩衝的作用，是相當特殊的胺基酸。 Only His has the residue with a neutral pKa (imidazole) pKa of a carboxylic or amino groups is lower than pKa of the R residues Juang RH (2007) BCbasics

pKa of Amino Acids ? ? pK2 pK1 pK3 pK2 pK1 pH two pKa Gly G 2.34 9.60 [OH-] pH Amino acids -COOH -NH2 -R Gly G 2.34 9.60 Ala A 2.34 9.69 Val V 2.32 9.62 Leu L 2.36 9.68 Ile I 2.36 9.68 Ser S 2.21 9.15 Thr T 2.63 10.4 Met M 2.28 9.21 Phe F 1.83 9.13 Trp W 2.38 9.39 Asn N 2.02 8.80 Gln Q 2.17 9.13 Pro P 1.99 10.6 Asp D 2.09 9.82 3.86 Glu E 2.19 9.67 4.25 His H 1.82 9.17 6.0 Cys C 1.71 10.8 8.33 Tyr Y 2.20 9.11 10.07 Lys K 2.18 8.95 10.53 Arg R 2.17 9.04 12.48 two pKa pK2 pI pK1 pK1 + pK2 2 three pKa pK3 ? pK2 ? 大多數 胺基酸都只有兩個官能基，有七個胺基酸含有第三個官能基；前者 pI 的算法是把兩個官能基的 pKa 平均即得，那有三個官能基應該如何計算？ 簡單的說，還是先去找到靜電荷為零的 pI ，然後把夾著 pI 的兩個 pKa 值平均即得，請看下頁的例子。 pI ? pK1 Juang RH (2004) BCbasics

Aspartic acid +1 -1 -2 2.1 + 3.9 = 3.0 2 Isoelectric point H first HOOC-CH2-C-COOH NH3+ H first +1 Isoelectric point is the average of the two pKa flanking the zero net-charged form pK1 = 2.1 HOOC-CH2-C-COO- NH3+ H second 2.1 + 3.9 2 = 3.0 Isoelectric point pK2 = 3.9 -OOC-CH2-C-COO- NH3+ H +1 -1 -2 -1 pK1 pK2 pK3 third pK3 = 9.8 Aspartic acid 有三個官能基，如何求得其 pI？ 初次練習時，最好像上圖左邊一樣，把分子式寫出來，並且由酸性環境開始，把各官能基的解離狀況寫好，也就是說質子該解離的就解離，不該解離的就要把 H+ 加上去。至於如何知道該不該解離，只要比較各基團的 pKa 與環境的 pH，即可得知。當環境的 pH 小於官能基的 pKa 時，因為環境比較起來偏酸 (pH < pKa)，則此官能基不便解離，應該加上質子；反之則減去質子。 如此，把每個基團的解離情形全部寫好。然後把每個不同 pH 下的淨電荷算出來，發現淨電荷變化由酸到鹼是 +1 → 0 → -1 → -2，可找到一個淨電荷為零的等電點，然後把等電點前後的兩個 pKa 平均即是等電點的值。 有點麻煩？ 在弄熟了原理之後，酸性胺基酸可以直接把靠酸性的那兩個 pKa 平均即可，而鹼性胺基酸則把較大的那兩個 pKa 平均。為何如此做的原理，也實在不難理解。 -OOC-CH2-C-COO- NH2 H -2 [OH] Juang RH (2004) BCbasics

Titration curves predict the charge of amino acids Isoelectric point, Isoelectric pH, pI 純化酵素是一件非常基本的工作，很多重要的研究，都脫不開酵素的純化工作。而大多數酵素的純化，基本上也脫不開一些最基本的原則。 首先，建立一個完善的酵素實驗室是很必要的；我們把許多實驗室內的運作細節一一交代，期望同學能認知這些經驗，確實接收並養成習慣，且期望應用到將來每個人的研究工作上。 最先遇到，但是最容易被忽視的步驟，就是材料處理及總蛋白質的抽取。將提醒你小心選擇採料的種類、時期、部位等，並選擇一個良好的粗抽取方式，以便有一個良好的開始。

Amino acids differ in their acid-base properties 純化酵素是一件非常基本的工作，很多重要的研究，都脫不開酵素的純化工作。而大多數酵素的純化，基本上也脫不開一些最基本的原則。 首先，建立一個完善的酵素實驗室是很必要的；我們把許多實驗室內的運作細節一一交代，期望同學能認知這些經驗，確實接收並養成習慣，且期望應用到將來每個人的研究工作上。 最先遇到，但是最容易被忽視的步驟，就是材料處理及總蛋白質的抽取。將提醒你小心選擇採料的種類、時期、部位等，並選擇一個良好的粗抽取方式，以便有一個良好的開始。

Amino acids differ in their acid-base properties 純化酵素是一件非常基本的工作，很多重要的研究，都脫不開酵素的純化工作。而大多數酵素的純化，基本上也脫不開一些最基本的原則。 首先，建立一個完善的酵素實驗室是很必要的；我們把許多實驗室內的運作細節一一交代，期望同學能認知這些經驗，確實接收並養成習慣，且期望應用到將來每個人的研究工作上。 最先遇到，但是最容易被忽視的步驟，就是材料處理及總蛋白質的抽取。將提醒你小心選擇採料的種類、時期、部位等，並選擇一個良好的粗抽取方式，以便有一個良好的開始。

Quiz 1: Net electric charge and pI of a peptide A peptide has the sequence : Glu-His-Trp-Ser-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly 1. What is the net charge of this peptide at pH 3, 8, and 11? 2. Estimate the pI for this peptide. 純化酵素是一件非常基本的工作，很多重要的研究，都脫不開酵素的純化工作。而大多數酵素的純化，基本上也脫不開一些最基本的原則。 首先，建立一個完善的酵素實驗室是很必要的；我們把許多實驗室內的運作細節一一交代，期望同學能認知這些經驗，確實接收並養成習慣，且期望應用到將來每個人的研究工作上。 最先遇到，但是最容易被忽視的步驟，就是材料處理及總蛋白質的抽取。將提醒你小心選擇採料的種類、時期、部位等，並選擇一個良好的粗抽取方式，以便有一個良好的開始。

Peptides are chains of amino acids 純化酵素是一件非常基本的工作，很多重要的研究，都脫不開酵素的純化工作。而大多數酵素的純化，基本上也脫不開一些最基本的原則。 首先，建立一個完善的酵素實驗室是很必要的；我們把許多實驗室內的運作細節一一交代，期望同學能認知這些經驗，確實接收並養成習慣，且期望應用到將來每個人的研究工作上。 最先遇到，但是最容易被忽視的步驟，就是材料處理及總蛋白質的抽取。將提醒你小心選擇採料的種類、時期、部位等，並選擇一個良好的粗抽取方式，以便有一個良好的開始。 Formation of a peptide bond by condensation

Peptides are chains of amino acids 純化酵素是一件非常基本的工作，很多重要的研究，都脫不開酵素的純化工作。而大多數酵素的純化，基本上也脫不開一些最基本的原則。 首先，建立一個完善的酵素實驗室是很必要的；我們把許多實驗室內的運作細節一一交代，期望同學能認知這些經驗，確實接收並養成習慣，且期望應用到將來每個人的研究工作上。 最先遇到，但是最容易被忽視的步驟，就是材料處理及總蛋白質的抽取。將提醒你小心選擇採料的種類、時期、部位等，並選擇一個良好的粗抽取方式，以便有一個良好的開始。 The pentapeptide serylglycyltyrosylalanylleucine, or Ser-Gly-Tyr-Ala-Leu

Biologically active peptides and polypeptides occur in a vast range of sizes 純化酵素是一件非常基本的工作，很多重要的研究，都脫不開酵素的純化工作。而大多數酵素的純化，基本上也脫不開一些最基本的原則。 首先，建立一個完善的酵素實驗室是很必要的；我們把許多實驗室內的運作細節一一交代，期望同學能認知這些經驗，確實接收並養成習慣，且期望應用到將來每個人的研究工作上。 最先遇到，但是最容易被忽視的步驟，就是材料處理及總蛋白質的抽取。將提醒你小心選擇採料的種類、時期、部位等，並選擇一個良好的粗抽取方式，以便有一個良好的開始。

Peptides have characteristic amino acid compositions 純化酵素是一件非常基本的工作，很多重要的研究，都脫不開酵素的純化工作。而大多數酵素的純化，基本上也脫不開一些最基本的原則。 首先，建立一個完善的酵素實驗室是很必要的；我們把許多實驗室內的運作細節一一交代，期望同學能認知這些經驗，確實接收並養成習慣，且期望應用到將來每個人的研究工作上。 最先遇到，但是最容易被忽視的步驟，就是材料處理及總蛋白質的抽取。將提醒你小心選擇採料的種類、時期、部位等，並選擇一個良好的粗抽取方式，以便有一個良好的開始。

Some proteins contain chemical groups other than amino acids 純化酵素是一件非常基本的工作，很多重要的研究，都脫不開酵素的純化工作。而大多數酵素的純化，基本上也脫不開一些最基本的原則。 首先，建立一個完善的酵素實驗室是很必要的；我們把許多實驗室內的運作細節一一交代，期望同學能認知這些經驗，確實接收並養成習慣，且期望應用到將來每個人的研究工作上。 最先遇到，但是最容易被忽視的步驟，就是材料處理及總蛋白質的抽取。將提醒你小心選擇採料的種類、時期、部位等，並選擇一個良好的粗抽取方式，以便有一個良好的開始。

There are several levels of protein structure 純化酵素是一件非常基本的工作，很多重要的研究，都脫不開酵素的純化工作。而大多數酵素的純化，基本上也脫不開一些最基本的原則。 首先，建立一個完善的酵素實驗室是很必要的；我們把許多實驗室內的運作細節一一交代，期望同學能認知這些經驗，確實接收並養成習慣，且期望應用到將來每個人的研究工作上。 最先遇到，但是最容易被忽視的步驟，就是材料處理及總蛋白質的抽取。將提醒你小心選擇採料的種類、時期、部位等，並選擇一個良好的粗抽取方式，以便有一個良好的開始。

Proteins can be separated and purified Crude extract Fractionation Ammonium sulfate (salting out) Dialysis Column chromatography 純化酵素是一件非常基本的工作，很多重要的研究，都脫不開酵素的純化工作。而大多數酵素的純化，基本上也脫不開一些最基本的原則。 首先，建立一個完善的酵素實驗室是很必要的；我們把許多實驗室內的運作細節一一交代，期望同學能認知這些經驗，確實接收並養成習慣，且期望應用到將來每個人的研究工作上。 最先遇到，但是最容易被忽視的步驟，就是材料處理及總蛋白質的抽取。將提醒你小心選擇採料的種類、時期、部位等，並選擇一個良好的粗抽取方式，以便有一個良好的開始。

Proteins can be separated and characterized by electrophoresis 純化酵素是一件非常基本的工作，很多重要的研究，都脫不開酵素的純化工作。而大多數酵素的純化，基本上也脫不開一些最基本的原則。 首先，建立一個完善的酵素實驗室是很必要的；我們把許多實驗室內的運作細節一一交代，期望同學能認知這些經驗，確實接收並養成習慣，且期望應用到將來每個人的研究工作上。 最先遇到，但是最容易被忽視的步驟，就是材料處理及總蛋白質的抽取。將提醒你小心選擇採料的種類、時期、部位等，並選擇一個良好的粗抽取方式，以便有一個良好的開始。

The amino acid sequences of millions of proteins have been determined 純化酵素是一件非常基本的工作，很多重要的研究，都脫不開酵素的純化工作。而大多數酵素的純化，基本上也脫不開一些最基本的原則。 首先，建立一個完善的酵素實驗室是很必要的；我們把許多實驗室內的運作細節一一交代，期望同學能認知這些經驗，確實接收並養成習慣，且期望應用到將來每個人的研究工作上。 最先遇到，但是最容易被忽視的步驟，就是材料處理及總蛋白質的抽取。將提醒你小心選擇採料的種類、時期、部位等，並選擇一個良好的粗抽取方式，以便有一個良好的開始。 Frederick Sanger

Short polypeptides are sequenced using automated procedures 純化酵素是一件非常基本的工作，很多重要的研究，都脫不開酵素的純化工作。而大多數酵素的純化，基本上也脫不開一些最基本的原則。 首先，建立一個完善的酵素實驗室是很必要的；我們把許多實驗室內的運作細節一一交代，期望同學能認知這些經驗，確實接收並養成習慣，且期望應用到將來每個人的研究工作上。 最先遇到，但是最容易被忽視的步驟，就是材料處理及總蛋白質的抽取。將提醒你小心選擇採料的種類、時期、部位等，並選擇一個良好的粗抽取方式，以便有一個良好的開始。

Large proteins must be sequenced in smaller segments 1. Breaking disulfide bonds 2. Cleaving the polypeptide chain: proteases 3. Sequencing of peptides 4. Ordering peptide fragments 5. Locating disulfide bonds 純化酵素是一件非常基本的工作，很多重要的研究，都脫不開酵素的純化工作。而大多數酵素的純化，基本上也脫不開一些最基本的原則。 首先，建立一個完善的酵素實驗室是很必要的；我們把許多實驗室內的運作細節一一交代，期望同學能認知這些經驗，確實接收並養成習慣，且期望應用到將來每個人的研究工作上。 最先遇到，但是最容易被忽視的步驟，就是材料處理及總蛋白質的抽取。將提醒你小心選擇採料的種類、時期、部位等，並選擇一個良好的粗抽取方式，以便有一個良好的開始。

Breaking disulfide bonds in proteins 純化酵素是一件非常基本的工作，很多重要的研究，都脫不開酵素的純化工作。而大多數酵素的純化，基本上也脫不開一些最基本的原則。 首先，建立一個完善的酵素實驗室是很必要的；我們把許多實驗室內的運作細節一一交代，期望同學能認知這些經驗，確實接收並養成習慣，且期望應用到將來每個人的研究工作上。 最先遇到，但是最容易被忽視的步驟，就是材料處理及總蛋白質的抽取。將提醒你小心選擇採料的種類、時期、部位等，並選擇一個良好的粗抽取方式，以便有一個良好的開始。

Cleaving the polypeptide chain: proteases 純化酵素是一件非常基本的工作，很多重要的研究，都脫不開酵素的純化工作。而大多數酵素的純化，基本上也脫不開一些最基本的原則。 首先，建立一個完善的酵素實驗室是很必要的；我們把許多實驗室內的運作細節一一交代，期望同學能認知這些經驗，確實接收並養成習慣，且期望應用到將來每個人的研究工作上。 最先遇到，但是最容易被忽視的步驟，就是材料處理及總蛋白質的抽取。將提醒你小心選擇採料的種類、時期、部位等，並選擇一個良好的粗抽取方式，以便有一個良好的開始。

Cleaving proteins and sequencing and ordering the peptide fragments 純化酵素是一件非常基本的工作，很多重要的研究，都脫不開酵素的純化工作。而大多數酵素的純化，基本上也脫不開一些最基本的原則。 首先，建立一個完善的酵素實驗室是很必要的；我們把許多實驗室內的運作細節一一交代，期望同學能認知這些經驗，確實接收並養成習慣，且期望應用到將來每個人的研究工作上。 最先遇到，但是最容易被忽視的步驟，就是材料處理及總蛋白質的抽取。將提醒你小心選擇採料的種類、時期、部位等，並選擇一個良好的粗抽取方式，以便有一個良好的開始。

Amino acid sequences can also be deduced by other methods New methods based on mass spectrometry permit sequencing of short polypeptides (20-30 a.a.) in just a few minutes. 2. Development of rapid DNA sequencing methods. 純化酵素是一件非常基本的工作，很多重要的研究，都脫不開酵素的純化工作。而大多數酵素的純化，基本上也脫不開一些最基本的原則。 首先，建立一個完善的酵素實驗室是很必要的；我們把許多實驗室內的運作細節一一交代，期望同學能認知這些經驗，確實接收並養成習慣，且期望應用到將來每個人的研究工作上。 最先遇到，但是最容易被忽視的步驟，就是材料處理及總蛋白質的抽取。將提醒你小心選擇採料的種類、時期、部位等，並選擇一個良好的粗抽取方式，以便有一個良好的開始。

Quiz 2: Sequence determination of a nonapeptide 1. A nonapeptide was determined to have the following amino acid composition: (Lys)2, (Gly)2, (Phe)2, His, Leu, Met. 2. The native peptide was incubated with 1-fluoro-2,4-dinitrobenzene (FDNB) and then hydrolyzed; 2,4-dinitrophenylhistidine was identified by HPLC. 3. When the native peptide was exposed to cyanogen bromide (CNBr), an octapeptide and free glycine were recovered. 4. Incubation of the native peptide with trypsin gave a pentapeptide, a tripeptide, and free Lys. 2,4-Dinitrophenyl-histidine was recovered from the pentapeptide, and 2,4-dinitrophenylphenylalanine was recovered from the tripeptide. 5. Digestion with the enzyme pepsin produced a dipeptide, a tripeptide, and a tetrapeptide. The tetrapeptide was composed of (Lys)2, Phe, and Gly. The native sequence was determined to be: 純化酵素是一件非常基本的工作，很多重要的研究，都脫不開酵素的純化工作。而大多數酵素的純化，基本上也脫不開一些最基本的原則。 首先，建立一個完善的酵素實驗室是很必要的；我們把許多實驗室內的運作細節一一交代，期望同學能認知這些經驗，確實接收並養成習慣，且期望應用到將來每個人的研究工作上。 最先遇到，但是最容易被忽視的步驟，就是材料處理及總蛋白質的抽取。將提醒你小心選擇採料的種類、時期、部位等，並選擇一個良好的粗抽取方式，以便有一個良好的開始。