第四章 酶（enzyme） 新陈代谢的千千万万的化学变化几乎都是在生物催化剂的催化下进行的。可以说，如果没有生物催化剂，就没有生命现象。生物催化剂是指在生物内产生的具有催化功能的生物大分子。从目前已知的研究成果看，我们可将生物催化剂分为两类，一类是酶（Enzyme），其化学本质是蛋白质，这是生物催化剂中最主要的一类，另一类是 Ribozyme（核酶），其化学本质是RNA，是20世纪80年代以来发现的生物催化剂。生物体系中的化学反应，除少数的反应外，几乎都是在酶催化下进行的。此类酶便是一类具有催化功能的蛋白质（包括简单蛋白质和复合蛋白质）。

第一节 酶的发展史 1783年：胃液消化而不是机械磨碎 1833年：Payer等人用乙醇沉淀出淀粉酶 1857年：Pasteur提出酒精发酵是酵母活细胞 1897年：Buchner兄弟提出酒精发酵是酵母细胞内容物 1913年：Michaelis & Menten 提出米氏公式 1926年：Sumner从刀豆中提出了脲酶结晶，证明酶是蛋白质 30年代：分离胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶结晶 1982年：T. Cech发现核糖酶（核酶；Ribozyme）

第二节 酶的性质 一、酶作为生物催化剂（ biological catalyst ）的酶和一般催化剂相比有以下的共性： 1．用量少而催化效率高 2．不改变化学反应的平衡点 3．降低反应的活化能

二、作为生物催化剂的酶有以下特性： 1）效率更高：是非催化的108 —1020倍；是其他催化的107 —1013倍 2）高度专一性：结构专一性，包括绝对专一性和相对专一性（族专一性和键专一性）；立体异构专一性，包括旋光异构专一性和几何异构专一性 3）易失活 4）易受调控 5）易受小分子的影响：辅酶、金属离子等

三、酶的化学本质：蛋白质，核酸（RNA） 化学本质是蛋白质的酶在所发现的酶中占绝大多数。其中有的是简单蛋白质，有的是结合蛋白质。 这类酶作为一种具有催化功能的蛋白质，象其他蛋白质一样，由氨基酸组成，具有一、二、三、四级结构。 化学本质是核酸的酶是1983年才发现的，正在进一步研究中。

四、酶的组成 单成分酶：这类酶分子中，只有蛋白质。 双成分酶：这类酶分子中，除了蛋白质外，还有一些对热稳定的非蛋白质的小分子物质，前者称酶蛋白，后者称辅助因子，可分二类，即辅酶（coenzyme）和辅基（prosthetic group）。 辅酶：与酶蛋白结合的不牢固，可用透析法除掉。 辅基：与酶蛋白结合的牢固，用透析法不能除掉。

单体酶∶ 只有一条多肽链的酶称为单体酶。一般都是催化水解反应的酶。它们是具有完整生物功能的、具独立三级结构的蛋白质分子。分子量在13000-35000之间。如: 溶菌酶、胰蛋白酶等。 寡聚酶： 有一条以上多肽链的酶称为寡聚酶。它以四级结构作为完整生物功能分子结构形式。亚基之间不是共价结合，彼此之间很易分开。分子量从35000到几百万。如:3-磷酸甘油醛脱氢酶。许多寡聚酶都是调节酶（变构酶和共价修饰酶）。

多酶体系： 细胞中的许多酶常常在一个连续的反应链中起作用，即前一个酶反应的产物恰是后一个酶反应的底物，依次完成一个系列反应。这种由几种酶彼此嵌合形成的复合体称为多酶体系。

五、酶的分类与命名 习惯命名法 1、绝大多数酶依据其底物来命名，如催化水解淀粉的称为淀粉酶；催化水解蛋白质的称为蛋白酶；催化水解核酸的酶称为核酸酶。 2、某些酶根据其所催化的反应性质来命名，如水解酶催化底物分子水解，转氨酶催化一种化合物上的氨基转移至另一化合物上。 3、有的酶结合上述两个原则来命名，例如琥珀酸脱氢酶是催化琥珀酸脱氢反应的酶。 4、在这些命名的基础上有时还加上酶的来源或酶的其他特点，如胃蛋白酶及胰蛋白酶；碱性磷酸酯酶及酸性磷酸酯酶等。

EC为Enzyme Commision(酶学委员会)之缩写 国际系统命名法 EC为Enzyme Commision(酶学委员会)之缩写 1）氧化还原酶（oxido-reducases） 2）转移酶（transferases） 3）水解酶（hydrolases） 4）裂合酶（lyases） 5）异构酶（isomerases） 6）合成酶（ligases）

第三节 酶的结构和功能 一、酶的活性部位（活性中心） 第三节 酶的结构和功能 一、酶的活性部位（活性中心） 酶的活性部位是指酶分子中结合底物并催化底物转化成产物的区域。结合部位决定酶的专一性，催化部位负责底物键的断裂形成新键，决定酶的催化能力。 活性部位有其共同的特点： 活性部位在整个酶分子中只占很小一部分 活性部位是具有三维结构的裂隙 底物与酶活性部位是通过次级键结合的 活性部位的裂隙具有高度疏水性 活性部位构象上的柔性

酶作用专一性的假说 锁钥学说

诱导契合学说：酶的活性中心与底物有相似的结构，当酶分子与底物分子接近时，酶蛋白受底物分子诱导，其构象发生有利于底物结合的变化，酶与底物在此基础上互补契合进行反应。

第四节 酶促反应动力学 一、酶的反应速率及初速度概念 第四节 酶促反应动力学 一、酶的反应速率及初速度概念 人们发现在反应开始不久的一段时间内，产物生成量与时间几乎成正比，但随着时间的增加，产物生成量与时间就不再成正比关系了，这可以从酶反应的进程曲线来说明。

二、底物浓度对酶促反应速度的影响

解释上述现象，比较合理的是“中间产物”假说。即：酶与底物先络合成一个中间产物（过渡态），然后此络合物再进一步分解，成为产物和游离态酶。 1. 中间产物学说

2.米氏方程 （Michaelis－Menten）的推导

3. 讨论 1）Km值的物理意义，即Km值是当酶反应速度达最大反应速度一半时的底物浓度，它的单位是mol/L，与底物浓度的单位一样。 3）同一种酶若有几种底物就有几个Km值。Km值随测定的底物、反应温度、pH 而改变。 4）Km值的大小可以反映酶与底物的亲和力。Km值最小的底物称为该酶的最适底物或天然底物。

5）Km与Ks k2>>k3时，Km≈k2/k1=Ks 7）Vm是酶的理论最大反应速度，也是一个动力学常数，也可作为酶的特征性常数。同一种酶对不同底物的Vm也不同，反应温度、pH 也影响Vm数值。

双倒数作图法测Km 和Vm

三、pH对酶反应速度的影响 在一定pH下，酶表现最大活力，高于或低于此pH，酶活力降低。把表现出酶最大活力的pH称为酶的最适pH。

酶的最适pH随底物种类和浓度，缓冲液种类和浓度的不同而改变。

pH影响酶活力的原因可能有以下几个方面： 1、过酸、过碱会影响酶蛋白的构象，甚至使酶变性而失活。 2、当 pH改变不很剧烈时，酶虽不变性，但活力受影响。因为pH会影响底物分子的解离状态（影响程度取决于底物分子中与酶结合的那些功能基的PK值）；也会影响酶分子的解离状态，最适pH与酶活力中心结合底物的基团及参与催化的基团的pK值有关，往往只有一种解离状态最有利于与底物结合，在此pH下酶活力最高；也可能影响到中间产物ES的解离状态。总之，都影响到ES的形成，从而降低酶活性。 3、pH影响分子中另一些基因的解离，这些基团的离子化状态与酶的专一性及酶分子中活力中心的构象有关。 总之，各种酶在最适pH时所处的解离状态，最有利于与底物结合并发生催化作用，因而活力最高。

四、温度对酶反应速度的影响 每一种酶，在一定条件下，只有在某一个温度下才表现出最大活力，这个温度称为该酶作用的最适温度。

温度对酶促反应速度的影响有两方面：一方面是当温度升高时，反应速度也加快。这与一般化学反应一样。另一方面，随温度升高而使酶逐步变性，即通过减少有活性的酶而降低酶的反应速度。酶反应的最适温度就是这两种过程平衡的结果，在低于最适温度时，前一种效应为主，在高于最适温度时，则后一效应为主，因而酶活性迅速丧失，反应速度很快下降。大部分酶在 60℃以上变性，少数酶能耐受较高的温度，如牛胰核糖核酸酶加热到100℃仍不失活。

最适温度不是酶的特征常数，与底物种类、作用时间、pH等因素有关。 酶的固态比在溶液中对温度的耐受力要高。通常酶制剂以固体保存为佳。

五、酶浓度对酶反应速度的影响 在酶促反应中，如果底物浓度足够大，足以使酶饱和，则反应速度与酶浓度成正比 。 须注意的是，上述成正比的关系是有条件的，一是底物浓度足够大，二是使用的酶必须是纯酶制剂或不含抑制剂、激活剂或失活剂的粗酶制剂。

问：要增大酶反应速度，何时采用提高[S]的方法，何时采用提高[E]的方法？

六、激活剂对酶反应速度的影响 凡是能提高酶活性的简单化合物，都称为激活剂。 具体归纳激活剂可按分子的大小分为以下三类： 1、无机离子，包括金属离子：K+、Na+、Ca2+ 、Mg 2+ 、Zn2+ 、 Fe2+ 阴离子：Cl - 、l - 、Br - 、I - 、PO43- 氢离子； 激活剂对酶作用的选择性。

2、中等大小的有机分子，主要包括某些还原剂（如使二硫键还原成巯基的还原剂）和金属螯合剂（如EDTA去除重金属队的抑制作用）； 3、少数具有蛋白质性质的大分子物质；这类激活剂是指可对某些无活性的酶原起作用的酶。即可将无活性的酶原激活成→有活性的酶（此部分将在后面详细讨论）。 胰蛋白酶原 肠激酶 胰蛋白酶

七、抑制剂对酶反应速度的影响 酶反应过程中，因加入某种物质而使酶反应速度下降的作用称为抑制作用。加入的物质叫酶的抑制剂。 酶的变性作用与抑制作用的区别：变性剂对酶的变性作用无选择性，而一种抑制剂只能使一种酶或一类酶产生抑制作用，或者说抑制剂对酶的抑制作用具有选择性。

抑制作用分为二种类型： 1、不可逆抑制作用：抑制剂与酶的必需基团以共价键结合而引起酶活力丧失，不能用透析或超滤等物理方法解除抑制而恢复酶活力。必须通过其他化学反应，才能将抑制剂从酶分子上移去。如氰化物和低浓度重金属的酶抑制作用。 2、可逆抑制作用：抑制剂与酶以非共价键结合而引起酶活力降低或丧失，能用用透析等物理方法除去抑制剂，而使酶复活。

可逆抑制作用和 不可逆抑制作用的动力学鉴别 ①反应系统中无任何抑制剂，v与E成直线关系(曲线1)； ②反应系统中有一定量的不可逆抑制剂，使一定量的酶钝化，只有当加入的酶量大于不可逆抑制剂量时，酶才表现出活力，因此得到不通过原点的直线，但斜率和曲线1相同（曲线2）； ③反应系统中有一定量的可逆抑制剂时，v与E成直线关系，并通过原点，但其斜率低于曲线1（曲线3）。

可逆抑制作用 竞争性抑制、非竞争性抑制、反竞争性抑制。

竞争性抑制作用 抑制剂具有与底物相似的结构，与底物竞争酶的结合部位，从而影响了底物与酶的正常结合。所形成的EI复合物，不能进一步分解成产物，酶反应速率下降。 抑制程度取决于底物及抑制剂的相对浓度，可通过增加底物浓度而解除抑制。 典型例子：丙二酸和戊二酸对琥珀酸脱氢酶的抑制作用。

请大家思考：如果酶催化反应体系中存在某种竞争性抑制剂，那么你所测定得到的米氏常数将发生什么样的变化？

竞争性抑制曲线：Vm不变，Km 变大

非竞争性抑制剂 酶可同时与底物和抑制剂结合，两者没有竞争作用。形成的中间三元复合物不能进一步分解为产物，因此酶活力降低。 抑制剂与酶活性部位以外的基团相结合，其结构与底物无共同之处，不能用增加底物浓度来解除抑制。 典型例子：亮氨酸是精氨酸酶的非竞争性抑制剂。

非竞争性抑制曲线 ：酶可同时与底物和抑制剂结合； Km 不变，Vm变小

反竞争性抑制曲线：先与底物结合，再与抑制剂结合； Km ，Vm均变小

第五节 酶活力的测定

一、酶活力的测定方法 1）测一定量底物反应完全所用的时间（平均速度） 如α-淀粉酶活力测定时，可以测定其达到终点色所需要的时间（未分解的淀粉与碘呈蓝色反应，当一定量的淀粉全部被淀粉酶分解成为与碘起反应的某种大小的糊精（棕色）时，即与人为配置的终点色一致时，便准确记录时间），因此，从淀粉的用量、达到终点色所需要的时间和样品稀释倍数就可以计算出酶的活力单位数。

2）测一定时间内反应产物的生成量（初速度） 中性蛋白酶的单位规定为在30℃和 pH7.0条件下，每分钟分解酪蛋白产生酪氨酸的微克数即为此酶的活力单位数。具体操作时，先取一定量的酶粉稀释液（稀释一定倍数），加入一定量的底物酪蛋白溶液，30℃水浴中保温 10分钟后，立即加入蛋白变性剂三氯醋酸，使酶变性失活，中止酶的活动。由于蛋白酶作用干酪蛋白后，有酪氨酸分解出来，酪氨酸和Folin-酚试剂作用后生成蓝色物质，根据颜色的深浅，在680nm比色测定后，知道有多少微克酪氨酸分解出来，从而计算出每克酶制剂在每一分钟内可分解出多少微克的酪氨酸，便是含多少单位。

酶活力（enzyme activity）：酶催化一定化学反应的能力。酶活力通常以在一定条件下，酶所催化的化学反应的初速率来确定。 二、酶活力与比活力 酶活力（enzyme activity）：酶催化一定化学反应的能力。酶活力通常以在一定条件下，酶所催化的化学反应的初速率来确定。 酶活力单位（active unit；U）：酶活力单位是根据某种酶在最适条件下，单位时间内酶作用的底物的减少量或产物的生成量来规定的。 U/ml；U/g（酶制剂）；U/mg（酶制剂） α-淀粉酶的活力单位规定为：在60℃、pH6.2的条件下，每小时可催化1g可溶性淀粉液化所需要的酶量为一个活力单位，或是每小时催化1ml 2％的可溶性淀粉液化所需要的酶量为一个活力单位。可见，各种酶的活力单位是不同的。

为了便于比较和统一活力标准，1961年国际酶学委员会（Enzyme Commission，简写为EC）曾作过统一规定：在标准条件下，一分钟内转化lμmol底物的酶量定义为一酶活力单位，亦即国际单位（IU）。如果底物有一个以上可被作用的键，则一个活力单位是指一分钟内使lμmol有关基团转化的酶量。上述“标准条件”是指温度25℃，以及被测酶的最适条件，特别是最适pH及最适底物浓度。 1972年国际酶学委员会又推荐一个新的酶活力国际单位，即Katal（Kat）单位。1Katal单位定义为：在最适条件下，每秒钟可使lmol底物转化的酶量；同理，可使lμmol底物转化的酶量为μKat单位。两种国际单位的换算关系如下： 1kat = 6×107U 1U = 16.67nkat

酶的比活力（specific activity）：每毫克蛋白具有的酶活力， U/mg（蛋白质）。 比活力是在酶学研究和提纯酶时常用到的表示酶制剂纯度的一个指标。 酶的转换数（turnover number）表示酶的催化中心的活性，它是指每秒内每一催化中心（或活性中心）所能转换的底物分子数，或每μmol酶活性中心每秒转换底物的μmol。米氏方程推导中的 K3即为转换数。

酶高效催化的机制 底物与酶的接近与定向效应：反应基团既靠近又定向，分子间反应变成分子内反应。 邻近效应是活性中心的底物有效浓度大大提高，从而提高反应速度。在生理条件下，底物浓度一般约为0.001mol·L-1，而酶活性中心的底物浓度达100mol·L-1，因此在活性中心区域反应速度必然大为提高。 定向效应是指底物的反应基团和催化基团之间或底物的反应基团之间正确地取向所产生的效应。 对酶催化来说，“邻近”和“定向” 是共同产生催化效应的，只有既 "邻近"又"定向"，才迅速形成过渡态，共同产生较高的催化效率，

底物的形变和诱导契合 当酶遇到专一性底物时，酶中某些基团可使底物分子发生形变，使其转变为过渡态，降低反应活化能。

酸碱催化 质子供体和质子受体的催化。 酶之所以可以作为酸碱催化剂，是由于很多酶活性中心存在酸性或碱性氨基酸残基，例如羧基、氨基、胍基、巯基、酚羟基和咪唑基等，它们在近中性pH范围内，可作为催化性质的质子受体或质子供体，有效地进行酸碱催化。

共价催化 是指酶对底物进行的亲核、亲电子反应。酶催化时，亲核的酶或亲电子的酶分别释出电子或吸取电子作用于底物的缺电子中心或负电中心，迅速形成不稳定的共价中间复合物，降低反应活化能以加速反应进行。其中亲核催化最重要。通常酶分子活性中心内都含有亲核基团，

活性中心部位的微环境 ：疏水微环境 酶活性中心内是一个疏水的非极性环境，其催化基团被低介电环境所包围，某些反应在低介电常数的介质中反应速度比在高介电常数的水中的速度要快得多。这可能是由于在低介电环境中有利于电荷相互作用，而极性的水对电荷往往有屏蔽作用。

上述降低酶活化能的因素，在同一酶中并非各种因素同时都发挥作用，然而也并非是单一机制，而是由多种因素配合完成的。

第六节 酶活性的调控 一、别构效应的调控 此种调节控制作用是由别构酶（allosteric enzyme）来调节的。别构酶也称为变构酶，它是一种可以通过与效应物的作用，使自己构象发生改变，从而活性发生变化。其酶分子上除了有活性中心（active site）外，还有别构中心(allosteric site)。 调节物（或效应物）与酶分子中的别构中心（调节中心或控制中心）结合后，诱导出或稳定住酶分子的某种构象，使酶活动中心对底物的结合与催化作用受到影响，从而调节酶的反应速度及代谢过程，此效应称为酶的“别构效应”。

一种别构效应形成的新构象大大地有利于后续分子与酶的结合，大大地促进酶对后续的底物分子域效应物）的亲合性。这便是“正协同效应”。这种别构酶称为具有正协同效应的别构酶。

二、可逆共价修饰调控 这种调控作用由共价调节酶（covalently modulated enzyme）起作用。共价调节酶的催化性质因受到一个小基团的共价修饰而发生显著变化，使其从有活性到无活性或相反。

三、酶原的激活 有些酶在生物体内首先合成出来的只是它的无活性的前体，称为酶原。这些酶原必须要在一定的条件下，去掉一个或几个特殊的肽键，从而使酶的构象发生一定的变化，才有活性，此过程叫酶原的激活。

思考题 1．酶的化学本质是什么？如何证明？它作为生物催化剂有何特点？近年来对酶的化学本质有何新看法？ 2．辅基与辅酶有何不同？它们与激活剂有何区别？ 3．影响酶促反应速度的因素有哪些？用曲线表示并说明它们各有什么影响。 4．进行酶活力测定时应注意什么？为什么测定酶活力时以测初速度为宜，并且底物浓度应大大地超过酶浓度？ 5．说明米氏常数（Km）及最大反应速度（Vm）的意义及应用。

6．何谓竞争性和非竞争性抑制作用？举例说明不可逆抑制剂及可逆抑制剂。研究抑制作用的理论意义及实践意义何在？ 7．何谓酶的专一性？酶的专一性有哪几类（举例说明）？如何解释酶作用的专一性？研究酶的专一性有何意义？ 8．当一酶促反应进行的速度为Vm的80％时，在Km及［S］之间有何关系？ 9.有1克淀粉酶制剂，用水溶解成1000毫升，从中取出1毫升测定淀粉酶活力，测知每5分钟分解0.25克淀粉。计算每克酶制剂所含的淀粉酶活力单位数（3000单位）。 （淀粉酶活力单位的定义：在最适条件下每小时分解1克淀粉的酶量称为1个活力单位）。

10．称取25毫克蛋白酶粉配制成25毫升酶溶液，从中取出 0．1毫升酶液，以酪蛋白为底物，用Folin一酚比色法测定酶活力，得知每小时产生1500微克酪氨酸。另取2毫升酶液，用凯氏定氮法测得蛋白氮为0.2毫克。若以每分钟产生l酪氨酸的酶量为1个活力单位计算，根据以上数据，求出： ⑴．1毫升酶液中所含的蛋白质量及活力单位。 ⑵．比活力。 ⑶．1克酶制剂的总蛋白含量及总活力。 11. 解释下列名词概念 ⑴．活力、比活； ⑵．全酶、单体酶、寡聚酶、多酶体系； ⑶．中间产物学说、诱导契合学说； ⑷．别构效应、别构酶； ⑸．固定化酶与固定化细胞； ⑹．酶原的激活；