实验三 新生大鼠大脑皮层混合细胞的培养和鉴定

一、实验目的 通过混合培养传代的方法纯化能得到星形胶质细胞，同时对其进行形态学的观察和相关的免疫抗原反应鉴定，旨在建立比较成熟的细胞培养系统，为后续实验中提供稳定的细胞来源。

二、实验材料、试剂与器材 1H-DMEM培养基；胎牛血清；小牛血清；N2 Supplement；多聚赖氨酸、Hoechst 33258、BrdU；羊抗鼠GFAP抗体、羊抗鼠BrdU抗体；FITC标记羊抗鼠二抗、PE标记的羊抗鼠二抗；FITC标记的羊抗鼠β-III-Tubulin抗体。 2 超净工作台；二氧化碳培养箱；低速台式离心机；活细胞工作站；倒置相差显微镜及照相系统；倒置荧光显微镜及照相系统；电热恒温鼓风干燥箱；电热恒温水槽；超声波清洗机；立式压力蒸汽灭菌器。

三、实验原理 混合细胞培养时主要取材于SD大鼠大脑皮层，体外剥离脑膜后机械吹打分散成单细胞悬液接种在血清培养基中，因为原代培养过程是将体内环境转变成体外环境，只有一小部分细胞成活下来，随着培养时间的延长，细胞开始成熟、分裂。原代培养约一周左右，细胞能长满皿底，细胞生长状态较好。胰酶消化原代培养的混合细胞并重新接种，大部分神经元死亡，在含有血清的培养条件下不断的传代导致细胞种类单一化，即为星形胶质细胞。相对于神经元的培养，神经星形胶质细胞的培养要简单，细胞对环境的变化要求较小。

神经胶质酸性蛋白（GFAP）是星形胶质细胞特异性胞内抗原，而神经细胞粘附分子（NCAM）是神经类细胞（包括神经胶质细胞、神经元以及神经前体细胞）表面特异性抗原；微管蛋白（tubulin）是组成神经元骨架的重要组成成分和原始神经上皮中所表达的最早的神经元标志物之一，其中III型β微管蛋白（β-III-tubulin）作为神经元特有标志物，被广泛应用于神经生物学研究中。本实验利用GFAP、NCAM、β-III-tubulin分别对体外培养的星形胶质细胞和神经元进行特异性抗原染色，鉴定细胞种类及纯度。

四、实验步骤 取出生48 h以内的新生大鼠，75%酒精擦拭消毒后断头处死，剪开头部皮肤，外撕，然后剪破颅骨，用眼科镊沿大脑前方夹断视神经，小心取出大脑放于90 mm塑料培养皿预冷的无菌Hank’s液中。在解剖显微镜下用脑科镊分开左右半球，除去脑膜以及上面的血管，并除去大脑前方的嗅球和下方的下丘脑，将剥离脑膜的大脑皮层转入另一含预冷Hank’s液的塑料培养皿中，清洗2-3次。将清洗后的大脑皮层转到5 ml离心管内，加入预冷的Hank’s，巴氏吸管吹打，直至组织块完全打散，液体成悬液状。1000-1200 r/min下离心10 min左右。离心三次，最后一次将Hank’s换成DMEM。调整细胞密度（约4×105 /ml），将细胞接种在包被有0.01% PLL的75 cm3细胞瓶内（培养基为H-DMEM+10% FBS+1%双抗）。37℃，5% CO2培养三天，第四天换液。以后每三天换液 。

【实验结果与分析】 SD大鼠大脑皮层神经类细胞原代培养第三天时，培养皿底部有小部分细胞开始贴壁生长；换液后继续培养约6 d左右，细胞铺满皿底，并且出现明显的分层现象，上层细胞形态比较单一，细胞呈二极或三极状，主要为未成熟的神经元和神经前体细胞；下层细胞呈铺展状，细胞较大，主要为星形胶质细胞。将混合培养长满皿底的细胞胰酶消化后重新接种，得到第一代细胞，并反复按此方法将细胞按1：3进行反复传代3-4次，因为在有血清条件下神经元在体外存活时间较短且不能分裂，所以随着细胞的传代次数的增加，神经元样细胞越来越少，细胞形态也越来越单一，同时发现随着传代次数的增加，细胞生长的速率越来越快。

混合细胞的鉴定 将原代长满以及传至第四或第五代的大鼠中枢神经系统细胞进行GFAP和NCAM免疫化学染色，鉴定细胞种类及细胞纯度。细胞吸出培养液后，0.01 M PBS（pH7.2）洗两次，每次5 min。吸去PBS，加入4%多聚甲醛，4℃冰箱固定过夜。然后PBS洗三次，每次5 min。滴加用PBS + NaN3（0.02%）+ BSA（3%）+ Triton X-100（0.2%)稀释的mouse anti-GFAP IgG (1：1000）或者rabbit anti-NCAM IgG（1：500）， 4℃冰箱过夜后PBS洗三次，每次5 min，再加入FITC标记的山羊抗小鼠或者山羊抗兔二抗，室温下作用45 min。吸去二抗，PBS洗三次，每次5 min，加入1 μM Hoechst 33258室温孵育5 min，PBS洗两次，共5 min，最后50%缓冲甘油（PBS配制）封片，荧光显微镜下观察阳性细胞。阴性对照采用PBS代替一抗或者二抗，结果阴性 。

【实验结果与分析】 分别对混合培养和不同传代次数的细胞进行神经胶质酸性蛋白（GFAP）和III型β微管蛋白（β-III-Tubulin）免疫荧光染色鉴定，从表一的结果可以看到，随着传代次数的增加，GFAP阳性细胞的比率在逐渐的提高，说明星形胶质细胞在不断的纯化。混合培养原代的免疫荧光结果显示含有部分神经元，同时在对P4代细胞的神经细胞粘着分子（NCAM）和GFAP免疫抗原染色也发现存在少部分阴性细胞，可能是由于在分离脑膜时未去除干净的少量成纤维细胞造成的。

图A：原代细胞GFAP免疫荧光鉴定；图B：混合培养原代β-III-Tubulin免疫荧光鉴定; 图C：P4代细胞NCAM免疫荧光鉴定；图D：P4代细胞GFAP免疫荧光鉴定。

【思考题 】 1、如何从混合细胞中纯化星形胶质细胞？ 2、混合细胞培养中培养的有哪几种主要的细胞类型，如何进行鉴定？