补充材料 基因打靶小鼠的制作

Ⅰ. 基因打靶的材料 1. 胚胎干细胞 (embro stem cell, ESC) 小鼠ES细胞是从着床前胚胎（孕3~5天）分离出的内细胞团（inner cell mass, ICM）细胞，它具有向各种组织细胞分化的多分化潜能，能在体外培养并保留发育的全能性。 2. 打靶载体

1. 胚胎干细胞 E14TG2a 细胞系 来自 129/Ola 小鼠 携带毛色基因: Agouti位点: AA； c 位点: cchcch , 和p 位点: pp 。 犬毛色基因位点 C： 该位点有四个等位基因、基因C使个体表现为有色毛；Cch表现为青紫蓝色； Ce表现为浅灰色；c使毛色为白色，他们的显性次序：C>Cch>Ce>c 兔的毛色基因： 全色(C),青紫兰(Cch),喜马拉雅(Ch)及白化(c) E14TG2a cell line From Strain 129/Ola mice carry mutations at three loci known to affect coat color: A, cch, and p. The 129/Ola mice agouti locus: homozygous for the dominant allele A c locus: the recessive allele cch p locus: recessive allele p

129/Ola 小鼠, AAcchcchpp, 奶白色并有粉红色眼睛. C57BL/6J ，aaBBCC，黑色 嵌合体Chimeras , 毛色表型为：来自受体囊胚的黑色背景上，镶嵌着几块由ESC发育成的表皮层生长出的浅颜色的毛皮。 epidermis(表皮) the presence of lighter patches of fur which layers of epidermis are ES cell-derived on a black background which are recipient blastocyst-derived.

嵌合体动物（Chimeras ） 嵌合体动物：将动物品系内、种内、种间或属间的两个或多个胚胎以聚合或注入等方法嵌合在一起培养，使之发育成一个胚胎，称为嵌合胚胎。再将此胚胎移植给假孕母体，发育成个体。把具有两种以上动物胚胎细胞的动物称为嵌合体动物。

验证 129/Ola mice , AAcchcchpp, Creamy-white colored with pink eyes. C57BL/6J ，aaBBCC，黑色 小鼠毛色表现型与基因型的关系是： A－B－C－D－,野生色； A－bbC－D－,桂皮色； aaB－C－D－,黑色； aabbC－D－,棕色； -- -- cc --,白化。 验证

Surrogate 借用品，替代

2. 打靶载体 （Targeting vector） a. 同源臂Homologous arms (打靶基因) b. 遗传标记 次黄嘌呤磷酸核糖转移酶基因 (hprt，hypoxanthine phosphoribosyl-transferase gene ), 次黄嘌呤核苷 neomycin resistance gene, neor（新霉素抗性基因）, 带G418的培养基, 细胞毒性药物,氨基糖苷类抗生素 单纯疱疹病毒—胸苷激酶基因(HSV-tk, herpes simplix virus thymidine kinase), 培养基中加入丙氧鸟苷 (Ganc )→毒性核苷酸 含有次黄嘌呤磷酸核糖转移酶（HPRT）编码基因缺陷的受体细胞（hprt -）不能在含有次黄嘌呤核苷、氨基喋 G418是一种细胞毒性药物（氨基糖苷类抗生素），依不同浓度，对细胞有一定的抑制

b. 遗传标记

① 正向选择基因 - neor Positive selection gene

② 正负双向筛选系统（Double positive-negative selection genes，PNS） 同源重组 对G418 和丙氧鸟苷Ganc都不敏感 随机整合 对G418 不敏感，但对丙氧鸟苷敏感 Medium with both G418 and Ganc Homologous recombination Not sensitive to both G418 and Ganc Random recombination Not sensitive to G418 but Ganc

Ⅲ. apoE 基因敲除 1. apoE 基因克隆 从小鼠apoE cDNA 克隆中分离获得apoE-特异性探针(Sac I/Bgl II 酶切片段) 来筛选文库。 The library was screened with an apoE-specific probe (a Sac I/Bgl II fragment) isolated from a mouse apoE cDNA clone.

用neo基因置换一 1.1-kb Sac I 片段，该片段携带从部分内含子1直到部分外显子3. 2. 打靶质粒构建 pJPB63, 7.8-kb EcoRI 片段 用neo基因置换一 1.1-kb Sac I 片段，该片段携带从部分内含子1直到部分外显子3. Construction of Targeting Plasmids Replacing a 1.1-kb Sac I fragment containing part of intron 1 through part of exon 3 with the neo gene.

3. 双向选择载体构建 pNMC109, 正负选择, 7.8-kb EcoRI 3. 双向选择载体构建 pNMC109, 正负选择, 7.8-kb EcoRI 用neo基因置换一 Xho I/ BamHI 片段，该片段携带从部分外显子3直到部分内含子3的碱基. HSV-TK 基因置于构建载体的3'末端 pNMC109, positive-negative selection, 7.8-kb EcoRI Replacing a Xho I/ BamHI fragment containing part of exon 3 and part of intron 3 with the neo gene. the HSV-TK gene was placed at the 3' end of the construct.

同源重组筛选鉴定 PCR 和 Southern blotting (d) Southern blot analysis of genomic DNA from parental (P) and targeted (T) cell lines. Fragment sizes are in kb

胚胎培養液培養至8個細胞期至接近孵化的囊胚期。 5. 囊胚 胚胎培養液培養至8個細胞期至接近孵化的囊胚期。 囊胚期胚胎植入懷孕率高。因： (1) 自然生理情形下，早期胚胎 (倍數分裂期的胚胎) 都是在輸卵管中發育的，直到極接近囊胚期才進入子宮腔。 (2)子宮環境易接受植入胚胎,不被排出體外。 (3)子宮腔內酸度比輸卵管內高。早期胚胎對酸度的調節功能較差，而囊胚期的胚胎對酸度的調節功能較好。因此在囊胚期時植回子宮，胚胎的存活率較高。 (4)染色體異常的胚胎 (約佔30% ~ 40%)，並不能發育至囊胚期。所以利用囊胚的培養技術，可有效的篩選出正常的胚胎進行植入，懷孕機會自然增高。

野生色毛斑, Aw 基因, 间接抑制黑色色素的作用 浅黄色毛斑, cch 和 p 基因, 直接作用于自己编码的色素 强烈嵌合体，几乎全身都是黄棕色或奶油色，并且有黑色眼睛。 Agouti patches, Aw gene, indirect inhibitory effects on black pigment. Light yellow patches, cch and p genes, direct effects on the the pigments themselves. Strongly chimeric, almost uniformly yellowish brown or cream colored with black eyes.

6. 打靶基因的传递 用嵌合体小鼠与C57BL/6J 小鼠交配 提取尾DNA 基因鉴定 Transmission of the targeted apoE gene Chimeric, mated to C57BL/6J mice. DNA , isolated from tails , the presence of a disrupted apoE gene.

嵌合体 ♂ C57BL/6J ♀ 黑色仔鼠,由来自囊胚的精细胞发育而成, aaBBCC 全身野鼠色仔鼠， 由来自ESC的精细胞发育而成 Aw 显性遗传 cch and p, 杂合子，不影响 两类仔鼠黑眼睛 Chimeras ♂ C57BL/6J ♀ black Pups, blastocysts sperm, aaBBCC uniformly agouti pups, ES cells sperm Aw dominant cch and p, heterozygous, not appreciably affect Both types of pup have black eyes.

两杂合子交配，产生的子代的血清，用兔抗大鼠apoE 血清 纯合子, -/-, 无可检测到的免疫沉积 immunoprecipitate 杂合子，+/- 或纯合正常 +/+ , 很清楚 Investigation of the presence of protein Plasma, Offspring between heterozygotes , a rabbit antiserum to rat apoE. Homozygous, -/-, no detectable immunoprecipitate Heterozygous +/- or homozygous normal -/- , clearly visible