Protein Purification (II) 蛋白質體學 Proteomics 2011 純化酵素是一件非常基本的工作，很多重要的研究，都脫不開酵素的純化工作。而大多數酵素的純化，基本上也脫不開一些最基本的原則。 首先，建立一個完善的酵素實驗室是很必要的；我們把許多實驗室內的運作細節一一交代，期望同學能認知這些經驗，確實接收並養成習慣，且期望應用到將來每個人的研究工作上。 最先遇到，但是最容易被忽視的步驟，就是材料處理及總蛋白質的抽取。將提醒你小心選擇採料的種類、時期、部位等，並選擇一個良好的粗抽取方式，以便有一個良好的開始。 Protein Purification (II) 陳威戎 2011. 10. 24.

3.2.2 交換介質 Exchange materials 3.3.3 緩衝液與層析系統 Buffer system 3.3 離子交換法 Ion exchange 3.3.1 原理概述 Basic principles 離子與固相擔体帶電基團間的爭奪戰 (Ion wars) 3.2.2 交換介質 Exchange materials 是帶有電荷基團的多醣長鏈聚合物 (膠球) 3.3.3 緩衝液與層析系統 Buffer system 緩衝液的影響極大 3.3.4 管柱操作方法 Column operation 如何操作一支離子交換管柱 說明文字 Juang RH (2005) EPA

擔 体 樣本分子 + + ■ 陰離子交換法 Anion Exchange： Counter ion 流動相 固定相 陰離子 陽離子基團 說明文字 陰離子 流動相 固定相 陽離子基團 +

Proton： 最小且最多的生物粒子，影響酸鹼度及分子帶電性質 ■ 質子可以吸著或脫離一基團： Proton： 最小且最多的生物粒子，影響酸鹼度及分子帶電性質 lone pair electrons H H+ N H N 胺 基 H+ 說明文字 羧 基 C O H C O H+

+ - ■ 選 10 擇 離 子 9 交 換 介 8 質 ： 7 6 5 4 3 Buffer pH 陰離子交換 pI 說明文字 陽離子交換 + - Net Charge of a Protein

- + pH = 7 pI = 6 pH = 5 OH- OH- + OH- OH- ■ 陰離子交換膠體的 pH 變化 Support OH- - pI = 6 離子交換介質表面的微環境會比緩衝液高或低一個 pH 單位： 例如上左圖的陰離子交換擔體，因為本身帶有正電，因此會吸引緩衝液中的 OH- 離子，造成擔體表面的局部高 pH。若有一樣本蛋白質的 pI 為 6，則使用 pH 為 7 的緩衝液，將使得此蛋白質帶有負電荷，可以吸附到上述陰離子交換介質。 而當此樣本蛋白質吸附到擔體時，微環境的 pH 事實上是 8 (比緩衝液多一個 pH)，因此會帶更多負電，更容易吸附到介質上。因此在這種情況下，所使用的緩衝液 pH 只要比樣本蛋白質的 pI 稍高或低 1 pH 單位即可，以免吸附太強而難以溶離下來。 OH- Counter ion + OH- pH = 5 Donnan Effect Juang RH (2005) EPA The pH change of the microenvironment surrounding the ion exchange gel particle

> > > ++ + + + + 電荷高者 離子大者 濃度大者 + ■ 離子取代優先順序 Displacing order of ions > ++ + 電荷高者 (higher charge) > + + 離子大者 (larger ion) 圖 3.7  離子取代順序： + > 濃度大者 (higher concentration) change pH, NaCl gradient + Key properties determining the order of ion replacement Juang RH (2005) EPA

Q S ■ 各種離子交換介質： Strong Exchanger Anion Weak Strong Exchanger Cation Mono bead 陰陽強弱分類 Resin / Polystyrene Glycan / Cellulose = X Anion Exchanger Dowex-1 -NR 3 + TEAE-X -NR 3 + Q Strong (QAE-X) Dowex-2 Dowex-3 -NHR 2 + DEAE-X Weak -OCH CH NHR 2 + 說明文字 IR-45 Cation Exchanger - -SO 3 4 2- -PO S Strong Dowex-50 Phospho-X -COO - 2 - -OCH COO Weak IRC-150 CM-X X = Sephadex, Sepharose, Sephacel or cellulose

Cellulose Sephacel Monobead ■ 膠體的組成與外型 Support material and bead Pharmacia (1980) Separation News: 5 Cellulose Sephacel Monobead ● Homogeneous bead shape is critical to its resolution and flow rate 說明文字 Pharmacia (1991) Ion Exchange Chromatography – Principles and Methods p.24

■ 不同膠體的吸著容量有很大差異 Lactalbumin Albumin Ferritin DEAE-Sephadex A-25 Adapted from Pharmacia (1991) Ion Exchange Chromatography – Principles and Methods p.64 Lactalbumin Albumin Ferritin DEAE-Sephadex A-25 DEAE-Sephadex A-50 DEAE-Sepharose CL-6B DEAE-Sephacel 191 10 45 38 31 102 115 86 2 1 4.3 8.6 說明文字 mg / mL gel Buffer: 0.01 M Tris-HCl, pH 8.0 Each gel has different adsorption capacity toward different target proteins

Both methods have their specific applications ■ 鹽梯度的兩種方式 Two ways for making gradient 膠柱面 Gel surface Dead volume 高限溶液 低限溶液 Eliminate dead volume 離子交換法多以鹽梯度進行溶離，有兩種梯度做法： 連續梯度需要梯度製造器 (左圖)，分別裝有高限及低限溶液，則可拉出由低到高的連續梯度。階段梯度則依序換各種濃度的緩衝液，成為樓梯般的段落，不須梯度製造器。不管用哪一種，管柱內膠面上方不可以有液體存在 (右圖)；這個多餘的體積，稱為 無效空間 (dead volume)，會破壞做好的梯度。 連續梯度 Continuous 連續梯度 階段梯度 Step-wise 階段梯度 連續梯度 Upper-limit Lower-limit 兩種方式均可，各有特點。 Both methods have their specific applications Pharmacia Juang RH (2005) EPA

■ 連 續 與 階 段 梯 度 比 較 連續梯度 Continuous gradient Protein concentration 0 50 100 150 200 連續梯度 Continuous gradient 0.1 0.2 0.3 0.4 Protein concentration 0 50 100 150 200 階段梯度 Step-wise gradient 說明文字 Adapted from Pharmacia: Ion Exchange Chromatography – Principles and Methods 0.1 0.2 0.3 0.4 Elution volume Continuous vs step-wise

Protein concentration ■ 鹽 濃 度 比 較 NaCl 0 20 40 60 80 100 0.1 0.2 0.3 Protein concentration 0 20 40 60 80 100 0.1 0.2 0.3 0.4 說明文字 Adapted from Pharmacia: Ion Exchange Chromatography – Principles and Methods Elution volume Effect of salt concentration

■ 溶 離 體 積 會 影 響 解 析 度 Relative absorption Elution volume 100 50 0.5 M NaCl 100 50 0.5 M Resolution improved but protein diluted Relative absorption 溶離體積越大，分離效果較好，但樣本濃度變稀： 同樣 0~0.5 M 的 NaCl 梯度，可以因為體積不同，而拉出不太一樣的結果。上圖的總體積只有 100 mL，看起來較為陡峭，但兩個溶離峰似乎沒有分得很好；下圖體積共有 300 mL，可以分得很開，但是但樣本變得很稀 (因為要分佈在 300 mL 範圍中)。因此，似乎中央的溶離方式比較折衷，兩峰之間分開了，而且不會太稀。 Adapted from Pharmacia: Ion Exchange Chromatography – Principles and Methods 0 100 200 300 100 50 0.5 M Elution volume Effect of elution volume

■ 管 柱 長 短 的 影 響 B A B A 5 cm column Protein concentration 10 cm column 0.03 0.04 0.06 0.1 0.2 0.5 1.0 ■ 管 柱 長 短 的 影 響 5 cm column B A Protein concentration 0.03 0.04 0.06 0.1 0.2 0.5 1.0 10 cm column B 說明文字 A Acetate concentration (M) Effect of column length

■ 離子交換法膠體之再生： (1) 蛋白質全部溶離出來後，交換介質要經過 再生 (regeneration) 後，才能再次使用。 (2) 以 1-2 M NaCl 即可洗去雜蛋白，澈底清洗可用 0.1 M NaOH 流洗；陰離子交換介質可用 1 M 醋酸鈉 (pH 3.0) 洗 1.5 個体積；再以緩衝液平 衡完全，才能再度使用。 (3) 可測流出液的 pH 或離子濃度，是否與加入的緩 衝液一樣。也可把膠体取出，在燒杯或漏斗 中澈底清洗。大多數失敗是因為再生不良！ 說明文字

■ 離子交換法操作要點 Summary on operation Equilibration Used gel should be regenerated and equilibrated well Elution Eluted with NaCl in continuous or step-wise gradient Gradient Use proper concentration and volume in elution Buffer pH Keep target proteins in weak charged state 離子交換操作的關鍵在於膠體是否平衡好： 離子交換法是所有層析法中，最多樣、有效、方便的分離方法，但其機制也較為複雜且容易出錯，請把握以上各操作要點。 Non-specific Wash out contaminants with low NaCl concentration Sample Equilibrated in buffer, don’t overload column capacity Elute through Flow target protein through and adsorb others Dead volume Eliminate any dead volume in the column Juang RH (2005) EPA

■ 離子交換法實例 Two-step cellulase purification FPLC (fast performance liquid chromatography) 0.2 M NaCl 0.5 10 20 30 0.5 10 20 Mono Q HR 5/5 1 mL/min 20 mM Tris, pH 7.6 Crude cellulase 2.5 mg + + S - + Q - 說明文字 0.5 M NaCl - Mono S HR 5/5 1 mL/min 20 mM acetate, pH 3.6 Retention time (min) Adapted from Pharmacia (1991) Ion Exchange Chromatography – Principles and Methods p.127

Protein content / Activity ■ 離 子 交 換 法 實 例 0.1 0.2 0.3 0.4 100 200 300 DEAE Sepharose CL-6B SDS-PAGE SS 0.1 0.2 0.3 NaCl Protein content / Activity 說明文字 Elution volume A typical example Juang RH (2005) EPA

電溶離裝置- Electroelution Device- Centrilutor

電溶離裝置- Electroelution Device- Centrilutor

微膜離心管- Centrifugal Concentrators Centriplus Centricon Microcon

微膜離心管- Centriplus, Centricon, Microcon

微膜離心管- Centriplus, Centricon, Microcon

微膜離心管- Centriplus, Centricon, Microcon

微膜離心管- Centriplus, Centricon, Microcon

■ 蔗糖合成酵素之純化表： 純化步驟 全蛋白質 回收率 全部活性 比活性 純化倍數 (mg) (U) (U/mg) (fold) (%) 粗抽取液 1,070 800 250 53 8.6 9,672 12,555 6,610 5,789 2,960 9.0 15.7 26.4 111.3 344.2 1.0 1.7 2.9 12.4 38.2 100 130 68 60 31 魚精蛋白沈澱後 上清 說明文字 硫酸銨分劃 (35-55%) Sepharose CL-6B 膠體過濾 DEAE Sepharose 離子交換